氯嘧磺隆对土壤真菌群落的影响

代英杰李万龙任守振张海君相磊

摘要：本文以氯嘧磺隆为唯一碳源，从多年施用氯嘧磺隆的土壤中经富集和分离纯化获得了8株氯嘧磺隆降解菌。采用玉米主根生长抑制率的生物测定法，对8株菌的氯嘧磺隆降解率进行测定，8株菌中除A-2-1和A-3外，其它6株菌4d内对10mg·L-1氯嘧磺隆的降解率均在60%以上。其中有4株菌的降解率达到了90%以上，它们分别是A-1、B-2、B-3和B-4，而最终筛选出1株氯嘧磺隆高效降解放线菌B-4，其氯嘧磺隆降解率可达97.2%。

关键词：氯嘧磺隆；氯嘧磺隆降解菌；分离筛选

引言

氯嘧磺隆在植物体内主要从处理部位（根和幼芽）向上传导，至生长点发挥作用。阻止植物体内乙酰乳酸合成酶（ALS）的活性而中断缬氨酸和异亮氨酸合成[1]。是一种选择性芽前、芽后除草剂，主要用于大豆田防除阔叶杂草。属于磺酰脲类除草剂。作用机制为抑制植物体内乙酰乳酸合成酶的活性而干扰支链氨基酸的合成。主要用于大豆除草，防除莎草、阔叶杂草及某些禾本科杂草[2]。氯嘧磺隆在土壤中残效期长，属长残效除草剂。长残效除草剂连续多年使用可能在土壤中持续积累，在连作或轮作农田中造成后茬敏感作物的减产或绝产，影响农业种植结构的调整及土壤资源的可持续利用。明确氯嘧磺隆对土壤微生态的影响，解决其残留药害问题，具有十分重要的理论和现实意义。由于残留期长，其土壤残留不仅对后茬敏感作物造成严重药害，导致作物减产或绝产，而且还可能对土壤环境造成污染。随着生物技术的迅猛发展，应用微生物进行生物修复已成为环境修复的一个重要内容[3]。因此，该研究拟从长期施用氯嘧磺隆的土壤中分离筛选出高效降解氯嘧磺隆的菌株，为开发生物治理氯嘧磺隆残留微生物菌剂及进行生物修复奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1土壤样品。

黑龙江省嫩江县大豆田间多年施用氯嘧磺隆的土壤，经粉碎，过筛。

1.1.2培养基。

富集培养基：蛋白胨0.5g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05g，蒸馏水100mL。

牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌分离）：牛肉膏0.3g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL。

马丁氏培养基（用于真菌分离）：蛋白胨0.5g，葡萄糖1g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05g，琼脂2g，蒸馏水100mL，加1%孟加拉红水溶液0.33mL，临用时每100mL培养基中加1%链霉素0.3mL。

改良高氏一号培养基（用于放线菌分离）：硝酸钾0.1g，磷酸氢二钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.05g，硫酸亚铁0.001g，可溶性淀粉2g，琼脂2g，蒸馏水100mL。

PDA培养基：马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，水100mL。

1.1.3试验器材。

恒温培养箱、人工气候箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、光学显微镜等。

1.2试验方法

1.2.1降解菌的富集。

取田间多年施用氯嘧磺隆的土壤样品10g，溶解于90mL灭菌的生理盐水中，制得土壤悬浊液。在250mL三角瓶中，加入100mL富集培养基（含氯嘧磺隆的浓度为100mg·L-1），按10%的接种量接种土壤悬液，于28℃，120r·min-1的摇床培养5d，将培养液按10%接种量接种于氯嘧磺隆浓度为200mg·L-1的新鲜富集培养基中，然后于28℃，120r·min-1摇瓶培养5d，依次类推10次接种，按氯嘧磺隆100mg·L-1的浓度梯度增长，使最终富集培养液的氯嘧磺隆的浓度达到1000mg·L-1，得到富集降解菌株培养物种子。

1.2.2降解菌的分离纯化。

降解菌富集过程中，每2次转接后，将菌悬液进行逐级梯度稀释。取0.15~0.2mL适当稀释梯度的样品溶液分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基和改良高氏一号培养基平板。于28℃培养2d，挑取单一菌落划线培养于分离平板，并通过反复平板划线并结合菌落形态和显微镜观察菌体形态进行分离纯化，直至获得纯菌株。然后将纯菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨、PDA和改良高氏一号斜面保存培养基中，于28℃下恒温培养2d后，放入4℃冰箱保藏备用。

2结果与讨论

2.1菌株的分离纯化

通过10次转接富集和5次分离，根据菌落形态特征并结合显微镜菌体特征观察，从土壤样品中共分离纯化出8株菌（见表1），其中5株细菌、2株放线菌和1株真菌（酵母菌）。按菌株种类分别接种于牛肉膏蛋白胨、PDA和改良高氏一号试管斜面培养基上，于4℃冰箱中保存备用。

表1从土样中分离纯化出的菌株

2.2氯嘧磺隆对土壤真菌多样性的影响

由于传统的培养方法只能观察到不到5%的土壤微生物群落，这给土壤微生物数量、组成和生态分布的测定带来了很多困难。无需分离培养的新方法被陆续引入土壤微生物分析中，如微平板法（BIOLOG）、变性梯度凝胶电泳法（DGGE）、磷脂脂肪酸（PLFA）分析等近年来得到广泛应用，弥补了传统培养中微生物多样性信息丢失的弊端，更真实可靠地反映土壤微生物的组成情况。其中，PLFA方法是根据不同类群微生物的指示性PLFA的不同，通过提和分离指示性PLFA，定量测定可繁殖或有潜在繁殖能力的不同类群微生物生物量和总生物量。

真菌/细菌比图1表明，土壤中真菌和细菌的比值会受到氯嘧磺隆的影响。除连续施药5年的土壤外，其他施用年限的土壤中真菌与细菌比均有不同程度降低。即长期施用氯嘧磺隆会影响土壤真菌和细菌比例，降低了土壤生态系统的稳定性。

图1氯嘧磺隆对真菌/细菌比的影响

3结论

通过富集与分离纯化最终得到8株以氯嘧磺隆为唯一碳源的氯嘧磺隆降解菌，其中有5株细菌，2株放线菌，1株真菌。对分离出的8株氯嘧磺隆降解菌进行筛选，最终筛选出一株氯嘧磺隆高效降解的放线菌B-4，其对氯嘧磺隆的降解率高达97.2%。土壤中真菌同生活着的微生物一起推动着物质转化，在碳、氮、硫、磷等元素的生物循环中都有土壤中真菌的作用。因此，土壤中真菌的活性可以作为判断土壤生化过程强度及评价土壤肥力的指标之一。

参考文献

[1]土壤微生物研究会.土壤微生物实验法[M].北京：科学出版社，1983：267-293.

[2]滕春红.氯嘧磺隆对土壤微生态的影响极其高效降解真菌的研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2006：24-31.

[3]中科院南京土壤研究所.土壤做生物研究法[M].北京：科学出版社，1985.