7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基异黄酮衍生物抗神经细胞氧化应激活性筛选

王春燕1董琳1夏红1杨胜圆2曹建国3郑

1南华大学医学院湖南衡阳421001;

2南华大学公共卫生学院湖南衡阳421001

3湖南师范大学医学院湖南长沙410006;

4南华大学药物药理研究所湖南衡阳421001

【中图分类号】R971【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)27-0026-04

【摘要】目的从7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基异黄酮衍生物中筛选出具有拮抗神经细胞氧化应激损伤活性的衍生物。方法采用过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞氧化应激损伤的模型，MTT法检测细胞增殖活性，碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡，多功能生化分析仪测定培养液上清中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。结果9种7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基异黄酮衍生物均对H2O2损伤PC12细胞有一定的拮抗作用，其中以7-二氟甲氧基金雀异黄素的效果最明显。结论7-二氟甲氧基金雀异黄素可望用于防治与氧化应激有关的神经退行性病变。

【关键词】7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基异黄酮衍生物PC12细胞氧化应激神经保护

EffectsofDerivativesof7-Difluoromethyl-genisteinonhydrogenperoxide-induceddamageinPC12cellline

Chun-YanWang,aLinDong,aHongXia,aShen-YuanYang,bJian-GuoCaoc#andXingZhengd#

aCollegeofMedicine,UniversityofSouthChina,28ChangshengRd,Hengyang,Hunan421001,PRChina

bSchoolofPublicHealth,UniversityofSouthChina,28ChangshengRd,Hengyang,Hunan421001,PRChinacCollegeofMedicine,HunanNormalUniversity,Changsha,Hunan410006,PRChina

dInstituteofphamacyandPhamacology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofDerivativesof7-difluoromethyl-genisteinonthedamageofPC12cellsinducedbyhydrogenperoxide(H2O2).METHODSH2O2-inducedPC12celldamagewasemployedasthemodelofneurondamageinducedbyoxidativestress.TheproliferationofPC12cellswasdeterminedby3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)assay,theapoptosisofPC12cellswasdetectedbyflowcytometry(FCM)withpropidiumiodidestaining,theLDHactivityofPC12cellsfunctionbymultifunctionbiochemistryanalysator.RESULTSAllofninederivativesof7-Difluoromethyl-genisteincaninhibitH2O2-induceddamageinPC12cellsandtheneuroprotectiveeffectof7-difluoromethylgenisteinisthebest.CLUSIONS7-difluoromethylgenisteinmaybeworkasanoveltherapeuticapproachtoneurodegenerativediseasewhichisassociatedwithoxidativestress.

【Keywords】Derivativesof7-difluoromethyl-genistein;PC12cells;oxidativestress;Neroprotection

阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一种老年神经系统的退行性疾病，许多研究发现，淀粉样蛋白(Aβ)堆积所导致的氧化应激损伤在神经退行性病变中具有重要的病因学意义，其中H2O2过量堆积与AD发病密切相关。氧化应激损伤涉及到氧化应激和抗氧化系统的失衡，因此，可以通过摄入抗氧化剂减轻氧化损伤[1]。

金雀异黄素(genistein,GEN)是一种来源于豆类植物的异黄酮，化学名为5,7,4’一三羟基异黄酮，具有广泛的生物活性，特别是具有较强的氧化应激损伤保护作用[2]。但金雀异黄素在肠道内吸收甚少，活性较低[3]，为了克服该缺点达到增强异黄酮类化合物生物活性的目的，在先前的研究中，我们已以金雀异黄酮作为先导化合物，将能显著增强化合物脂溶性的二氟亚甲基（CF2）引入金雀异黄素中，设计7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基-金雀异黄素系列衍生物为目标分子，（烷氧基化可有效改善化合物生物活性），采用现代有机化学合成技术，合成获得9个含二氟甲氧基金雀异黄素衍生物供试品，并将9个供试品(图1)。化合物对应的检测代号如下:化合物2即FMGEN;化合物4a即GEN-1;化合物4b即GEN-2;化合物4c即GEN-3;化合物4d即GEN-4;化合物4e即GEN-5;化合物4f即GEN-6;化合物4g即GEN-7;化合物4h即GEN-8。

我们以往应用过氧化氢诱导人血管内皮细胞氧化应激损伤模型，筛选得到7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素对血管内皮氧化应激损伤的保护作用最强[4]。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，在细胞形态、结构和功能上与神经元极其相似，能与原代培养的神经细胞说明一致的问题[5]，本文以H2O2损伤PC12细胞为氧化应激损伤神经元的模型，观察9个含二氟亚甲基的金雀异黄素衍生物和金雀异黄素对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用，从中筛选出最有效的对神经细胞氧化应激损伤具有选择性保护作用的活性新化学实体。

1材料与方法

1.1主要试剂30%H2O2购自中国广州金华大化学试剂有限公司，RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司，胎牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、二甲基亚砜购自美国Amresco公司，四甲基偶氮盐（MTT）、金雀异黄素购自美国Sigma公司，7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基-金雀异黄素系列衍生物，由湖南师范大学药物化学研究室合成。

1.2仪器流式细胞仪，美国BECKMAN-COUL-TER公司产品(ELITE，激光波长488nm，功率15mW)。酶联免疫仪，美国Bio-TEK公司产品(E1x800)。全自动分析仪，日本日立公司产品

1.3细胞和细胞培养PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，细胞株由中山大学实验动物中心引入，培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃,5%CO2条件下培养。选取对数生长期细胞做实验。

1.4实验分组和给药方法实验按处理方法分为4组：①空白对照组:不加任何药物处理；②H2O2损伤组:培养基中加入40μmol/LH2O2常规培养24h；③金雀异黄素组:在加入40μmol/LH2O2前30min加入不同浓度的金雀异黄素(0.l、1.0、10μmol/L)；④7-二氟甲氧基-5，4’–二取代烷氧基-金雀异黄素系列衍生物组:在加入40μmol/LH2O2前30min加入不同浓度的7-二氟甲氧基金雀异黄素(0.l、1.0、10μmol/L)。

1.5MTT法检测细胞增殖活性取对数生长期细胞，以5000个/孔细胞接种于96孔培养板。在37℃,5%CO2条件下培养24小时后，按分组要求给以不同处理因素，每组设3个平行孔。培养24h后，吸弃培养基，每孔加含MTT(0.5mg/mL)、无血清培养基200μL，再培养4h，吸弃培养液，每孔加DMSO100μL,震荡10min使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶联免疫仪在波长570nm处读取吸光度(A)。取3孔A值的均数按公式计算细胞抑制率(inhibitoryrate,IR):IR＝(1-试验孔均值/对照孔均值)X100%，以上重复5次。

1.6PI染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡药物处理24h后，0.25%胰蛋白酶消化贴壁的PC12细胞，1000rmin-1离心10min，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加入体积分数为0.7的乙醇固定。PI染色上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性测定培养PC12至细胞融合率达80%左右时，按上述实验分组处理细胞，继续孵育24h，收集培养液(每个样本收集lmL,置于EP管内)，用全自动生化分析仪测定LDH含量。

1.8统计学处理全部数据经SPSS12.0统计软件进行统计分析，数据用s、表示，两两比较采用Students’t检验，P＜0.05为统计学意义显著性标准。

2结果

2.17-二氟甲氧基-5,4’-二取代烷氧基异黄酮类供试品对PC12细胞氧化应激损伤模型LDH释放量的影响

为了从我们合成的9个7-二氟甲氧基-5,4’-二取代烷氧基异黄酮类化合物筛选出有效的保护神经细胞氧化应激损伤新型候选药物，我们采用7-二氟甲氧基-5,4’-二取代烷氧基异黄酮类化合物的不同浓度组(10、1.0、0.lμmol/L)分别处理细胞24h后，测定H2O2(40μmol/L)孵育细胞培养液中LDH的活性。结果显示，H2O2孵育的PC12细胞培养液中LDH活性明显增高，由正常时的26.00±1.00U/ml升高到92.67±5.86U/ml，在所有的供试品中，均可抑制H2O2诱导PC12细胞LDH释放，其中以7-二氟甲氧基金雀异黄素(FMGEN)对H2O2诱导PC12细胞LDH释放的抑制作用最明显，其抗氧化应激损伤作用效价强度为先导物金雀异黄素的100倍，且呈剂量依赖性。

2.27-二氟甲氧基-5,4’-二取代烷氧基异黄酮类供试品对PC12细胞氧化应激损伤模型细胞凋亡的影响

流式细胞分析术结果显示，H2O2孵育的PC12细胞，细胞凋亡率明显增高，由正常时的0.89±0.06%增高到34.07±3.44%。在所有供试品中，均可降低H2O2诱导PC12细胞凋亡，其中以7-二氟甲氧基金雀异黄素(FMGEN)降低H2O2诱导PC12细胞凋亡作用最明显，FMGEN(0.1、1.0、10μmol/L)使细胞凋亡率依次降低到13.83±0.42%、5.99±0.46%、2.89±0.37%，呈剂量依赖性。

2.37-二氟甲氧基-5,4’-二取代烷氧基异黄酮类供试品对PC12细胞活性的影响

MTT比色法结果显示，H2O2孵育的PC12细胞，细胞的抑制率明显增高到36.14%。在所有供试品中，均可降低H2O2诱导PC12细胞的抑制率，其中以7-二氟甲氧基金雀异黄素(FMGEN)降低H2O2诱导PC12细胞的抑制率作用最明显，FMGEN(0.1、1.0、10μmol/L)使细胞凋亡率依次降低到33.32%、13.80%、1.99%。

3讨论

金雀异黄素（genistein,Gen）是一种从大豆中提取的异黄酮类化合物，在结构上与雌二醇相似，具有植物雌激素性质。Gen具有许多显著的生物学活性，表现为抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、杀菌、抗氧化、抗突变、抗高血压、抗炎和抗增生的特性[6]。Gen的防病作用机理之一是其具有强的抗氧化应激的作用[2]。

含氟有机化合物在自然界中十分少见。目前，只有少量的热带和亚热带植物，以及两种放线菌中分离得到[7]。尽管如此，对含氟化合物的研究仍旧引起了有机化学家，药物化学家的广泛兴趣。这主要是由于选择性的将氟引入化合物后，能够使其化学、物理性质和生物活性得到很大改变。目前临床上使用的许多抗感染药物、抗癌药物、非甾体抗炎药物、中枢神经系统药物等都是含氟的，例如：氧氟沙星、安确治等[8]。

科学工作者对含氟化合物研究的不懈努力，使人们逐渐认识到了氟原子以及含氟基团的一些特性。无疑是这些特性造成了含氟化合物和其对应的非氟化合物之间生物活性的显著差别。总结这些特性主要有以下几点[9]：

1）氟原子的范德华引力半径（rF=1.35A°）和氢原子的范德华半径（rH=1.20A°）最为接近，而且C-F键的键长（1.317A°）和C-H的键长（1.091A°）也很接近。这就意味着分子中一个氢原子被氟原子取代后，分子的空间体积并不会有多大改变，因而也就不易被生物体中的酶识别，能毫无困难地使非氢母体进入生物的代谢过程。

2）氟原子的电负性（4.0）远大于氢原子的电负性（2.1），使得C-F键强烈极化，因而能有效地影响邻近碳原子中心的反应，改变其反应行为。

3）C-F键能大大增加化合物的亲脂性（lipophilicity）,二氟甲氧基是迄今所知道的增加有机化合物亲脂性的最为有效的官能团之一。因此，氟原子的引入将明显地增加有机物的亲脂性，表现为含氟化合物对组织细胞生物膜具有很强的穿透能力，从而提高含氟化合物在生物体中的吸收和跨膜转运速率[10]。

4）二氟甲氧基是氧的等极体（isopolar）[11]。

金雀异黄素具有抗氧化应激、细胞保护作用，但活性较低，究其原因，主要是金雀异黄素在肠道内吸收甚少[3]。为了克服该缺点达到增强异黄酮类化合物生物活性的目的，国内外广大科研工作者试用将其制成水溶性的衍生物，以便制成注射剂，使其在体液中能迅速达到有效浓度。令人遗憾的是各种尝试收效甚微[12]。现代药理学研究表明，影响药物吸收的两个主要因素是水溶性（aqueoussolubility）和膜通透性（membranepermeability）,当我们根据化合物的理化性质来预测其膜通透性时，最主要的一个指标是脂溶性，一般来说，脂溶性越高，药物越容易通过细胞膜而被吸收[7]。为此，我们已以金雀异黄酮作为先导化合物，将能显著增强化合物脂溶性的二氟甲氧基（CF2）引入金雀异黄素中，设计7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基-金雀异黄素系列衍生物为目标分子，（烷氧基化可有效改善化合物生物活性[7]），采用现代有机化学合成技术，合成获得9个含二氟甲氧基金雀异黄素衍生物供试品，以期获得高效、低毒的选择性保护神经细胞氧化应激损伤的含氟异黄酮类新候选药物。

PC12细胞在细胞形态、结构和功能上与神经元极其相似，与原代培养的神经细胞有高度一致性[5],并具有易于稳定培养的优点,已被广为用作研究神经细胞的模型[13]。H2O2属于活性氧,在体内可转变成细胞毒性极强的·OH,是一种膜易透性氧化剂，在许多神经元细胞培养模型中引起了细胞损伤[14-15]。为验证上述科研假设和达成预期研究目标，我们建立以PC12细胞为实验对象，以H2O2损伤为处理因素，以细胞乳酸脱氢酶的释放，细胞存活力，细胞凋亡为观察指标的抗氧化应激损伤神经细胞的药物筛选模型，从9个含二氟亚甲基金雀异黄素衍生物供试品中筛选最有效的对神经细胞氧化应激损伤具有选择性保护作用的活性新化学实体。

我们的结果表明9种7-二氟甲氧基-5，4’-二取代烷氧基异黄酮类衍生物均对H2O2损伤PC12细胞有一定的拮抗作用，其中以7-二氟甲氧基金雀异黄素的效果最明显。7-二氟甲氧基金雀异黄素可望用于防治与氧化应激有关的神经退行性病变，值得进一步研究。

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