靶向EMMPRINsiRNA减轻牙周组织破坏的体外研究

曹玉林

摘要:目的探究靶向EMMPRINsiRNA减轻牙周组织破坏的体外研究成果。方法本次研究收集病情轻重不同的牙周病组织，建立HGEC和牙周成纤维细胞（包括PDLCs或HGF）共培养模型，经由体外实验法，分析靶向EMMPRINsiRNA与宿主牙周易感性之间关联。结果EMMPRINsiRNA与重度牙周炎、上皮细胞中EMMPRIN表达水平以及EMMPRIN基因之间存在一定的关联。结论减轻MMPs能够降低牙周组织破坏程度，有助于为探究牙周病治疗新思路提供具有一定可靠性的研究数据。

关键词：EMMPRINsiRNA；牙周病；MMPs

1研究意义

牙周病是人类发病率最高的慢性感染性疾病，特点是牙周袋形成、结缔组织附着丧失和牙槽骨吸收，最后造成牙齿脱落,在我国牙周病患病率高达90％,而人群中只有15~20%发展为重度牙周炎，提示宿主因素在重度牙周炎发病机制中发挥重要作用。以自主研究和国内外相关研究的结果为依据，我们提出“EMMPRIN可能与重度牙周炎的宿主易感性相关，是导致牙周组织破坏的重要因素”。本课题将通过体外实验，检测不同个体来源的牙龈上皮细胞中EMMPRIN的表达水平，分析EMMPRIN-MMPs通路与重度牙周炎的相关性；用靶向siRNA沉默上皮细胞中EMMPRIN基因，探寻减轻MMPs对牙周结缔组织胞外基质破坏的方法。课题结果将揭示EMMPRIN在重度牙周炎宿主易感性方面所发挥的作用，为探寻牙周炎的发病机理提供资料。

2国内外研究现状分析

虽然菌斑微生物是牙周炎的始动因子，但近来研究表明在牙周炎的危险因素方面，牙菌斑仅发挥约20%的作用。牙周炎在不同的个体中发生和发展的差异性，提示宿主因素在牙周炎的易感性（susceptibility）方面发挥极为重要的作用[1,2]。为什么大部分患者停留在牙龈炎或轻中度牙周炎状态而不发展为重度牙周炎？流行病学资料显示重度牙周炎只占10-15%[3]，什么因素造成了这些人群对牙周炎易感，甚至在年轻时就罹患重度牙周炎？人群易感性是牙周病学亟待解决的重大理论问题。

MMPs是造成牙周组织破坏的关键酶类[4]。研究表明，MMPs的水平和酶活性与牙周炎的严重程度密切相关[5]。MMPs的表达受到复杂的调控网络调节，具体的调节机制仍不明了。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）是最近发现的MMPs强力调节因子。EMMPRIN通过刺激MMPs的表达，在诸多的生理和病理过程中发挥重要作用。Emingil等发现：健康人龈沟液中可检测到较低浓度的可溶性EMMPRIN，而牙周炎患者龈沟液中可溶性EMMPRIN的水平显著增高，且EMMPRIN的水平与牙周炎的严重程度密切相关[6]。该课题小组还发现小剂量强力霉素能降低慢性牙周炎患者龈沟液中可溶性EMMPRIN的水平[7]。

EMMPRIN/MMPs信号通路在牙周炎组织降解过程中的调控机制研究，通过体内、外实验全面揭示了EMMPRIN在牙周组织不同状态下的细胞定位、动态表达和相关意义（其主要发现和相关研究成果已经或即将在国际牙科杂志上发表）。实验结果如下：

（1）健康人和大鼠牙龈组织均可检测到EMMPRINmRNA和蛋白的表达，在牙周炎时，其表达水平均显著上调。人牙龈组织中，EMMPRINmRNA表达水平与MMP-1或MMP-2的水平相关，与牙周炎的炎症程度相关。免疫组化染色结果还显示，EMMPRIN蛋白主要表达于人牙龈上皮细胞（humangingivalepithelialcells,HGEC），且随着炎症加重，EMMPRIN的表达呈增强趋势[8]（图1、2）。

上述结果提示：EMMPRIN在健康的牙周组织中广泛、弱表达，主要定位于上皮细胞。可能与组织的生理改建相关。牙周炎时，上皮中的EMMPRIN表达水平显著上调，从而刺激牙周膜细胞（periodontalligamentcells,PDLCs）和牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,HGF）MMPs的表达，导致牙周结缔组织组织胞外基质的降解；

（2）体外培养的PDLCs和HGF在受到IL-1β,TNF-α或TGF-β1作用后，MMPs的mRNA和蛋白表达均发生显著改变。虽可在蛋白和mRNA水平检测到EMMPRIN的表达，但其表达水平在这些细胞因子作用前后并无显著差异[9]。

刺激细胞MMPs表达上调的因素很多，包括细胞因子和EMMPRIN。上述结果提示EMMPRIN不参与细胞因子对牙周成纤维细胞MMPs水平的调节，它可能是独立于细胞因子的另一上调MMPs的重要因素。牙周炎急性炎症期，除了渗出的炎性细胞所释放的MMP-8，还有大量细胞因子所诱导的其它类型MMPs共同参与对牙周组织的破坏[10]。然而细胞因子的特性是产生快，消失也快，其水平随时波动，其作用难以持久。那么EMMPRIN的刺激特性如何？是否EMMPRIN不会轻易被启动，而一旦启动，其作用和影响长久且强大？EMMPRIN是否为造成重度牙周炎患者牙周组织大量破坏的重要因素？

（3）体外培养不同个体来源的HGEC，用牙龈卟啉单胞菌脂多糖（PorphyromonasgingivilisLipopolysaccharides，PgLPS）作用后检测EMMPRINmRNA的水平，结果显示：来源于健康人、牙龈增生、牙龈炎或轻中度牙周炎患者的上皮细胞中EMMPRINmRNA的水平在作用前后无显著差异，而来源于重度牙周炎患者，特别是侵袭性牙周炎患者的HGEC在受到PgLPS作用后，EMMPRINmRNA的表达显著上调。

上述结果提示：EMMPRIN可能为重度牙周炎的易感基因之一。牙周炎易感人群的HGEC在受到牙周主要致病菌Porphyromonasgingivilis的毒力因子LPS作用后，EMMPRIN在转录水平发生显著改变，而对于非易感人群，PgLPS对HGECEMMPRIN的表达无显著影响[11]。

综合国内外综合研究，我们提出如下猜想：EMMPRIN-MMPs通路有别于细胞因子-MMPs通路，可能与重度牙周炎宿主易感性相关。对于大多数人群，EMMPRIN仅参与正常的生理改建，外界刺激难以显著上调其表达；而对于重度牙周炎易感人群，牙周病原微生物可导致EMMPRIN水平显著增高，从而“开启”（switchon）MMPs对牙周组织胞外基质的大量破坏。

本课题将通过建立HGEC和牙周成纤维细胞（包括PDLCs或HGF）共培养模型，探讨不同个体来源的HGEC所表达的EMMPRIN对成纤维细胞MMPs和胶原表达的影响，分析EMMPRIN-MMPs通路与牙周炎，特别是重度牙周炎的相关性；用靶向siRNA沉默HGEC中EMMPRIN的基因表达，观察可否减轻MMPs对牙周组织破坏，从而进一步验证上述猜想，并为探寻牙周病治疗提供新思路。

图1EMMPRIN在牙龈组织中的表达

注：（1）A和B为正常牙龈，C和D为轻度牙周炎牙龈，E和F为重度牙周炎牙龈。EMMPRIN在正常人类牙龈中的弱表达，主要集中于上皮基底层，在轻度牙周炎中其表达增强。在重度牙周炎中，EMMPRIN的表达水平和表达范围均显著增强，上皮全层均可观察到EMMPRIN的强阳性表达，在上皮下结缔组织中，EMMPRIN还表达与成纤维细胞，渗出的炎性细胞和血管内皮细胞。由此图可以看出，随着牙周炎症的增强，EMMPRIN的表达水平增高。（2）放大倍数：图A、C和E为10×，图B、D和F为20×。

图2EMMPRIN，MMP-1，MMP-2mRNA在正常和炎性牙龈中的表达

注：1-3泳道：正常对照；4-6泳道：侵袭性牙周炎；7-9泳道：慢性牙周炎病人。EMMPRINmRNA的表达水平与MMP-1或MMP-2mRNA的表达水平相关，与牙周炎的严重程度相关。

研究目标、研究内容和拟解决的关键问题、拟采取的研究方法及可行性分析、本项目的创新之处、预期研究进展、预期成果

一、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1研究目标：

本课题将从牙周炎的宿主易感基因之一——EMMPRIN入手，探寻宿主因素在重度牙周炎发病机制中所发挥的作用；并运用RNAi技术沉默牙龈上皮细胞EMMPRIN的表达以减轻MMPs对牙周结缔组织胞外基质破坏。

2研究内容：

1）体外实验研究EMMPRIN-MMPs通路与牙龈炎，轻中度和重度牙周炎宿主易感性的相关性；

2）靶向siRNA沉默HGEC的EMMPRIN基因，观察其对PDLCs或HGFMMPs的效应。

3）加入外源性EMMRPIN蛋白，观察其对PDLCs或HGFMMPs的效应。

3拟解决的关键问题：

通过一系列体外研究，探讨EMMPRIN-MMPs通路在重度牙周炎病理过程中所发挥的作用；并运用RNAi技术，初步论证通过沉默牙龈上皮细胞EMMPRIN的表达可否减轻MMPs对牙周组织破坏。

二、拟采取的研究方法及可行性分析

1研究方法：

1.1研究EMMPRIN与牙周炎宿主易感性的关系

1）细胞培养：1HGEC培养：收集健康牙龈组织，牙龈炎、轻中度慢性牙周炎和重度慢性牙周炎患者的牙龈组织★，记录牙周检查数据，并用酶消化法原代培养HGEC。用携带有SV40T抗原基因的质粒pMT10D转染上皮细胞获得永生化的HGEC细胞株（Kusumoto,etal.JPeriodontol2004;75:370-379.）；2PDLCs和/或HGF培养：组织块法原代培养，传代。4-6代细胞用于本研究；

★：1正常牙龈组织标本来源于牙冠延长术切除的牙龈。诊断标准为：牙龈色泽正常，无探诊出血，无附着丧失（clinicalattachmentloss，CAL），牙周袋深度（pocketdepth，PD）≤2mm，牙无松动，X线片显示无牙槽骨吸收；2牙龈炎组织标本来源于牙冠延长术或因炎性增生行牙龈切除术所切除的牙龈。诊断标准为：牙龈呈鲜红或暗红色，探诊出血，无附着丧失（clinicalattachmentloss，CAL），牙周袋深度（pocketdepth，PD）≤2mm，牙无松动，X线片显示无牙槽骨吸收；3慢性牙周炎诊断参考AAP1999年标准。严重程度标准：CAL1-2mm为轻度，CAL3-4为中度，CAL≥5mm为重度.

2）PgLPS对HGEC的表达影响：用不同浓度（0-10mg/ml）PgLPS作用于HGEC，运用real-timeRT-PCR,western-blot和ELISA等方法检测EMMPRIN的表达水平，分析EMMPRIN与牙周检查各项指标的相关性，EMMPRIN与牙周炎，特别是重度牙周炎的相关性，同时分析出PgLPS对HGEC作用的最佳浓度和时间；

图3HGEC和PDLCs/HGF共培养共培养模式图

3）HGEC和PDLCs/HGF共培养：用Transwell?建立共培养模型（见图3），将不同浓度PgLPS（0~10mg/ml）作用后的HGEC与PDLC或HGF共培养。用基因芯片，real-timeRT-PCR,western-blot,ELISA,明胶酶谱等方法检测PDLC和HGF中MMPs和Ⅰ、III、Ⅳ、Ⅴ型胶原（collagen）的表达水平。分析EMMPRIN与MMPs的相关性，MMPs与胶原表达水平相关性，以及不同个体来源的HGEC在不同浓度LPS刺激下对成纤维细胞胶原和MMPs表达的影响。

1.2不同个体来源HGEC和PDLCs/HGF交互作用共培养分析

1)由第一部分得到HGEC和PDLCs/HGF共培养模式下的LPS合适的刺激量指标。将不同严重程度个体来源的HGEC与PDLCs和/或HGF共同培养，分为6组。分别用正常人的HGEC和牙龈炎，轻中度牙周炎，重度牙周炎的PDLCs/HGF共培养；牙龈炎，轻中度牙周炎，重度牙周炎的HGEC和正常人的PDLC共培养，探讨不同严重程度来源的牙周炎组织的HGEC和PDLCs/HGF的相互之间的影响和作用差异。

如下图所示：

图4不同个体来源HGEC和PDLCs/HGF交互共培养模式图

2）效应检测：对共培养细胞的MMPs和Ⅰ、III、Ⅳ、Ⅴ型胶原（collagen）的表达水平进行检测，分析不同个体来源细胞之间相互作用效应，探讨EMMPRIN与MMPs表达相互作用的可能机制。

1.3靶向EMMPRINsiRNA对MMPs表达的影响

1）构建靶向EMMPRINsiRNA载体：参照Chen等的方法（Chen,etal.CancerRes2006;66:11323-11330），将2个包含EMMPRIN功能区基因序列和限制性酶切位点★的长64bp的寡核苷酸分别转入质粒pSUPER，获得靶向EMMPRIN基因沉默（knockdown）载体pSUPER/EMMPRINsiRNA;

★：1序列1：正义，5’-GATCCCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTGGAAA-3’;反义，5’-AGCTTTTCCAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACGGG-3’.2序列2,5’-GATCCCCTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTGGAAA-3’;反义,5’-AGCTTTTCCAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCAGGG-3’.

2）细胞转染：筛选第一部分实验中对PgLPS敏感的HGEC细胞株，将载体pSUPER/EMMPRINsiRNA用LipofectAMINE2000转染入该细胞；

3）效应检测：转染后的HGEC经PgLPS作用后，与PDLC或HGF共培养。用基因芯片，real-timeRT-PCR,western-blot,ELISA,明胶酶谱等方法检测PDLCs和HGF中MMPs和Ⅰ、III、Ⅳ、Ⅴ型胶原的表达水平，分析作用前后MMPs和胶原的表达差异，评估靶向EMMPRINsiRNA可否减轻MMPs对牙周组织的破坏。

1.4外源性EMMPRIN对MMPs表达的影响

1）筛选第一部分试验中对PgLPS不敏感的HGEC细胞株，将外源性EMMPRIN蛋白加入该培养体系。

2）效应检测：用基因芯片，real-timePCR，westernblot，ELISA，酶谱分析等方法检测PDLCs和HGF中MMPs和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原的表达水平，分析作用前后MMPs和胶原的表达差异，评估外源性EMMPRIN可否加重MMPs对牙周组织的破化。

参考文献

[1]杨希.葛根素作为牙周炎宿主调节治疗药物的研究[D].武汉大学,2015.

[2]何艳萍,谢明,焦婷.种植体周龈沟液中EMMPRIN及其配体CyPA的表达[J].口腔医学,2015,35(3):175-178.

[3]何艳萍.牙周及种植体周龈沟液中EMMPRIN及其配体CyPA的表达[D].上海交通大学,2011.

[4]韩伟,向军波.EMMPRIN与牙周炎的相关性研究[J].口腔医学研究,2013,29(10):964-967.

[5]李成章.牙周组织中EMMPRIN-MMPs-牙周炎路径研究[C]//第十次全国牙周病学学术会议论文摘要汇编.2014.