l金匮肾气丸对腺嘌呤致雄性不育大鼠精子质量与性激素含量影响

马亮王宗仁南亚昀贾敏刘镘利马静(通讯作者）

【摘要】目的观察金匮肾气丸对腺嘌呤致雄性不育大鼠精子质量及性激素含量的影响。方法30只成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组、腺嘌呤组、金匮肾气丸组。应用自动精子质量分析仪检测实验大鼠的质量（精子密度、活率及活动度）；同时应用放射免疫法测定血清睾酮（T）、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的含量；透射电镜观察实验大鼠睾丸组织精子鞭毛密度，支持细胞、精原细胞、初级精母细胞等结构。结果金匮肾气丸能显著改善腺嘌呤致雄性不育大鼠的肾阳虚症状，提高精子密度、活率及活动度；金匮肾气丸能明显改善提高大鼠血清T的含量，降低LH、FSH的含量；金匮肾气丸能改善模型大鼠睾丸组织受损的支持细胞。结论金匮肾气丸可提高腺嘌呤致不育模型大鼠的精子质量，其机制之一可能是通过提高血清中T的含量及修复受损的支持细胞这一间接作用实现的。

【关键词】腺嘌呤；不育；肾阳虚；金匮肾气丸；精子；睾丸；大鼠

【Abstract】Objective:ToobservetheinfluenceofJinkuiShenqiPillonadenine-inducedinfertilityratsonspermqualityandcontentsofhormones.Methods:30adultmaleSDratswererandomlypidedintoJinkuiShenqigroup,adeninegroupandcontrolgroup.Spermqualityofexperimentalratsweredetectedbyautomaticspermqualityanalyzer,andcontentsoftestosterone(T),luteinizinghormone(LH)andfollicle-stimulatinghormone(FSH)weremeasuredbyradioimmunoassay.Toobservetestisbytransmissionelectronmicroscopy.Results:JinkuiShenqiPillcansignificantlyimprovesymptomsofShen-yangdeficiencyinadenine-inducedinfertilityrats,improvethespermquality,includingdensityofsperm,vialiblityofspermandactivityofsperm.ItcanincreasecontentofTobviously,lowercontentsofLHandFSH.Anditcanbetterthedamagedsertolicellsoftestisinrats.Conclusion:JinkuiShenqipillcanimprovespermqualitysignificantly.AndthemechanismmaybetoincreasecontentofT,repairdamagedsertolicells

【Keywords】Adenine;Infertility;Shen-yangDeficiency;JinkuiShenqiPill;Sperm;Testis；Rat

流行病学资料显示，全世界约有10%-15%已婚夫妇不孕或不育，其中男性不育约占50%。男性不育是男科学中较常见的临床综合征，是由于精子的产生、成熟、运输或射精能力缺陷等引起的不能生育的总称。由于环境和社会心理等因素的影响，其发病率呈不断上升趋势。研究发现腺嘌呤可导致大鼠的生殖机能发生一定程度的病理改变，且模型大鼠呈中医肾阳虚的表现[1，2]。我们用金匮肾气丸对模型大鼠进行干预，观察其精子质量及血清性激素含量及睾丸组织结构的改变。

材料和方法

1材料

1.1动物5月龄SD大鼠30只，雄性，清洁级，体重（300±20）g（第四军医大学实验动物中心）。普通饲料，定时定量喂食，自由饮水，12小时光照12小时黑夜交替喂养。

1.2主要试剂及仪器腺嘌呤(Sigma公司)，睾酮（T）、雌二醇（E2）、促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所)；XH6080γ-放射免疫计数器（中国核工业部西安仪器厂）、以色列SQA-V全自动精子质量分析仪、日立全自动生化分析仪、JEM2000EX透射电镜。

2方法

2.1分组将30只大鼠随机分为3组，每组10只，分为空白对照组、腺嘌呤组、金匮肾气组。参照文献[3],将腺嘌呤按每日300mg/kg,以3ml蒸馏水制成混悬液，给腺嘌呤组和金匮肾气丸组灌胃，共30d,以制备雄性大鼠肾阳虚不育模型。腺嘌呤组和金匮肾气丸组大鼠每日分别灌服生理盐水和金匮肾气丸混悬液各3ml,共30d。空白对照组每日灌服生理盐水3ml,共60d。

2.2药物制备金匮肾气丸所需药物附子、桂枝、熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、茯苓、泽泻等，由第四军医大学西京医院药剂科提供。按常规方法煎药，浓缩至1.35g/ml（以生药计算），4℃冰箱保存，以成人剂量10倍给药。

2.3取材药物干预后第31d,用2%戊巴比妥40mg/kg麻醉大鼠，开胸，左心室取血6-9ml,静置2h,分离血清，-70℃冰箱保存；分离附睾、睾丸；附睾剪碎获取精子，睾丸组织做电镜标本。

2.4观察指标

2.4.1附睾中精子质量取附睾头部组织适量，每次尽可能使其大小一致，置3ml37℃生理盐水中，剪碎，温浴15min,得精子悬液，用自动精子分析仪检测精子质量。

2.4.2血清T、FSH、LH含量由西京医院检验科内分泌室参照北京北方生物技术研究所试剂盒提供方法检测。

2.4.3电镜观察睾丸组织观察精子鞭毛数量，支持细胞，精原细胞、初级精母细胞等组织结构。

3统计学处理

测定数据用±s表示,采用SPSS12.0统计软件进行统计分析,组间均数差异的显著性检验采用方差分析。

结果

1一般表现

腺嘌呤组和金匮肾气组大鼠在经腺嘌呤灌胃第10d左右始出现活动、采食和饮水量减少，尿量增多等肾阳虚表现；第20d左右出现质量减轻、活动减少、反应迟钝、弓背蜷缩、畏寒、体毛枯疏、失去光泽等表现。空白对照组大鼠则在质量、进食、饮水、活动、反应等方面未出现明显变化；分别给腺嘌呤组和金匮肾气组大鼠灌服生理盐水及金匮肾气丸混悬液30d后，腺嘌呤组大鼠的上述表现未见明显改善，金匮肾气组大鼠则在进食、饮水、体重、活动等方面较给药前明显恢复，体毛恢复光泽，尿量减少。

23组大鼠附睾中精子质量比较

与空白对照组相比，腺嘌呤组大鼠的精子密度、精子活率及活动度明显下降（*P<0.05）金匮肾气组较腺嘌呤组大鼠精子密度、活率及活动度明显增加（**P<0.05）。见表1。密度比较见图1。

33组大鼠血清T、LH、FSH比较

与空白对照组相比，腺嘌呤组大鼠血清T明显降低，FSH和LH显著增高（*P<0.05），金匮肾气组与腺嘌呤组相比，血清T明显增加，LH、FSH降低（**P<0.05）。见表2。

与空白对照（d）组相比，腺嘌呤组（e）睾丸支持细胞破坏明显；金匮肾气组（f）较腺嘌呤组睾丸支持细胞较完整。各组睾丸精原细胞未见明显改变。见图2。

讨论

实验表明，在用腺嘌呤灌胃后，大鼠不仅出现中医学认为的肾阳虚表现，且精子质量、性激素水平及睾丸组织结构发生改变。由于这些改变与人类肾阳虚不育较为相似，故国内外学者多采用腺嘌呤灌胃或放入饲料的方法来研究肾阳虚不育的病理机制及治疗作用。腺嘌呤诱导的雄性不育的病理机制尚未明了，有学者认为腺嘌呤可直接降低17β-固醇脱氢酶(17β-HSD)的活性，导致T合成减少，或者通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统影响睾丸血液循环而损害性腺[4]；有学者发现，腺嘌呤可引起雄性大鼠睾丸间质细胞中转化生长因子-β（TGF-β）表达异常，而抑制生精作用[5-8]；有研究者认为TGF-β超家族的细胞内信号转导分子Smads蛋白在大鼠睾丸生精细胞、间质细胞中的异常表达，影响了睾丸的生精功能[9,10]。

中医学认为肾藏精，主生殖，精子的生成依赖于肾阴的滋养与肾阳的温煦。肾精亏损或肾阳不足均可以出现精子异常，生殖机能减退。金匮肾气丸为中医经典的温补肾阳方剂，组成并非以补肾壮阳药物为主。而是以少量温阳补火药与大堆滋阴益精药为伍，旨在阴中求阳，少火生气；以补为主，佐以通散渗利，寓补于泻，使补而不滞，充分体现了中医理论对组方的指导。

临床观察报道金匮肾气丸治疗肾阳虚不育有效，本实验应用金匮肾气丸干预腺嘌呤致不育大鼠后发现，它不仅可改善大鼠的肾阳虚症状，且可以提高精子质量和改善性激素水平。这为金匮肾气丸治疗肾阳虚型不育证提供了一定的实验依据。电镜观察到金匮肾气丸可始模型大鼠精子数量明显增多，且能使明受损的支持细胞得到一定程度的恢复。另有研究表明[11]，金匮肾气丸治疗肾阳虚不育的机制尚有进睾丸间质细胞数目和功能明显增强，促进T的分泌；恢复受损的支持细胞，为各级精子成熟起着营养和保护的作用。本实验尚未观察到金匮肾气丸对间质细胞的作用及对生精细胞的直接影响，未研究相关生长因子与蛋白在上述组织中表达的改变，故需进一步深入研究其作用机制。

参考文献

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