高效液相色谱-质谱/质谱联用法快速检测牛奶中的氯霉素

李雪

摘要：目的：探究色谱－质谱/质谱联用法（HPLC－MS/MS）在氯霉素的筛查检测实践中的应用效果。方法：以牛奶为例进行氯霉素的筛查检测验证，首先对牛奶中的蛋白质等干扰因素通过乙腈过滤去除，检测样品的萃取则采用乙酸乙酯，富集提取后通过ThermoHypersilGold色谱柱分离试样中的氯霉素，流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，电喷雾负离子MRM模式检测。结果：利用HPLC-MS/MS检测方法可有效测出牛奶中的氯霉素，且此检测法的检出限值0.004μg/kg，测定范围为0.25μg/kg～1.25μg/kg，相关系数0.9978，平均加标回收率为98.7%，相对标准偏差为0.5%。结论：采用HPLC-MS/MS检测法，能够有效、准确测定牛奶中的氯霉素残留量，操作过程具有显著的高效性，且重复性好。

关键词：高效液相色谱-质谱/质谱联用；氯霉素；牛奶

[Abstract]objective：toexploretheapplicationeffectofchromatography-massspectrometry/massspectrometry（hplc-ms/MS）inthescreeningtestofchloramphenicol.Methods：verifiesthescreeningtestsofchloramphenicolinmilk，forexample，firstofall，theproteininmilkbyacetonitrilefiltertoremoveinterferencefactorssuchastestsampleswereusingethylacetateextraction，enrichmentafterextractionbyThermoHypersilGoldchromatographiccolumnseparationofchloramphenicolinthesample，mobilephasewas0.1%formicacidaqueoussolution-acetonitrile，negativeionselectrosprayMRMpatterndetection.Results：usingHPLC/MS/MSdetectionmethodcaneffectivelydetectthechloramphenicolinmilk，andthemethoddetectionlimitof0.004mug/kg，measurementrangefrom0.25mug/kgto0.25mug/kg，thecorrelationcoefficientof0.9978，withrespecttotheaveragerecoverywas98.7%，relativestandarddeviationis0.5%.Conclusion：HPLC-MS/MSdetectionmethodcaneffectivelyandaccuratelydeterminechloramphenicolresiduesinmilk.Theoperationprocessishighlyeffectiveandreproducible.

[Keywords]highperformanceliquidchromatography-massspectrometry/massspectrometry；Chloramphenicol.Milk

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种常用的抗生素，能够对多种病原体起到抑制作用，但临床研究证实，在利用CAP对食物进行抗菌处理后，CAP残留现象明显，且有临床病例表明CAP对人体表现出了较强的毒副作用，其通过对人体造血功能进行印制而诱发贫血、粒状白细胞缺乏症[1]。此外，除了对人体造成不利影响外，氯霉素长期低浓度作用于病菌，将会提高致病菌的耐药性，因此欧美等发达国家严格限制了动物饲料中氯霉素的残留量，甚至设置了“零容许量”的限量标准；牛奶作为人们常用饮品，内部有氯霉素残留的风险，威胁消费者身体健康[2]。目前国内外对氯霉素残留情况的检测方法众多，但不同的检测方法差异性较大，对残留量的辨识率也参差不齐。本文采用HPLC－MS/MS检测方法联合同位素内标法对牛奶中氯霉素药物残留情况进行检测试验，为牛奶中氯霉素残留量的检测提供了方法。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

色谱柱：Ther-moHypersilGOLDTM，100mm×2.1mm×3μm；液相质谱：watersxevoTQD，USA）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；乙酸乙酯（色谱纯）；氯霉素、D5氯霉素；实验样品为超市内采购的牛奶。标准储备液（0.1mg/ml）：将氯霉素标准物质配制成0.1mg/ml的标准储备溶液，于-18℃下保存。标准中间溶液的制备：稀释标准储备液，最终提取100μl置于4℃环境下保存以备试验所用。根据试验测试的具体情况制备内标中间溶液（100ng/ml）：吸取100μl的内标储备液，用乙腈－水（50：50，V/V）稀释至刻度，于4℃下保存。

1.2方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：ThermoHypersilGOLDTM；流速调整为恒定的0.3ml/min；柱温设定为35℃；样本的检测逐步、分批次推进，以5μl/次的测定速率将待检测样本进行逐步测量；检测过程以流动相进行，具体构成成分为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），具体的梯度数据见表1。

表1流动相成分梯度表

1.2.3分析方法

样品提取：量取1.0000g样品置入50ml离心管，与10μl内标中间溶液、5ml水、10ml乙腈进行涡旋混合，通过超声、离心操作将上层液体提取，加入少许无水硫酸钠提取上清液，再通过乙酸乙酯去除残渣，静置后吸取40ml上清液于蒸发瓶内并进行旋转蒸发；待用样品净化：量取5ml上述提取液，并置于HLB固相萃取小柱上，通过小柱时需控制流速（＜3ml/min），用5ml水和5ml乙腈-水溶液（1：7，V/V）反复淋洗柱子，减压抽干5min以上。根据检测过程的具体操作情况，将洗脱液进行回收，通过氮气对回收液进行吹干处理，最后将残留物通过乙腈溶解处理并置于待测瓶内。

1.2.4标准曲线的绘制与样品测定标准

系列工作溶液的制备情况：将混合标准中间溶液和内标中间溶液进行稀释处理，根据实际情况选取乙腈-水（50：50，V/V）溶液作为稀释物，最终配制成浓度为0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的混合标准系列溶液，内标浓度均为2ng/ml；装入1.5ml样品瓶待测。

2结果

2.1测定范围与最低检出浓度

对测定结果统计，根据试验数据的相关特点，对数据通过线性回归处理和分析，测定范围为0.25μg/kg～1.25μg/kg。回归方程为y=0.24625x+0.073069（y为峰面积；x为浓度，ng/ml）；线性相关系数r为0.9978；该方法检出限为0.004μg/kg。

2.2质谱条件优化处理

首先对母离子进行扫描处理，具体的操作为借助50ng/ml的氯霉素标准溶液实施，分子离子为m/z321.0。本方法以m/z321.0为母离子，为了得到子离子，采取对母离子轰击的措施，对产生的子离子进行筛选，监测离子对的选择上应充分对比分析离子丰度及受干扰情况，优先选择丰度高、干扰小的离子对，定量离子对则对丰度的要求更高，将丰度最高的设定为定量离子对；使选定的子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳，得到氯霉素的最佳质谱参数。

2.3氯霉素色谱条件优化处理及色谱图

根据氯霉素的典型特性，在进行试验时结合实际情况对色谱条件进行具体的优化处理，由于其归属于极性化合物序列，因此需在色谱柱下通过0.1%甲酸水溶液－乙腈进行梯度洗脱以便实现利于色谱峰的分离及峰形的改善，最终能够达到更好的分离样品中氯霉素的目的。具体色谱图见图1。

图1氯霉素色谱图

2.4方法的回收率和精密度

取6份空白样品，将样品中逐一添加氯霉素标准品，使之内标含量达到2ng/ml，进行测定。实验显示，加标回收率达到了较高水平，具体为98.7%，相对标准偏差（RSD）为0.5%。各样品回收情况见表3.

2.5实际应用

随机选择不同的市场，并进行随机购买6种牛奶样品，严格按照本次研究方法进行检测，通过对检测数据进行处理分析，结果显示均未检出氯霉素残留；用本法做质控样测定结果为0.55μg/kg，在质控范围（0.58μg/kg±0.029μg/kg）内。

3讨论

表36份样品回收率和精密度

氯霉素广泛用于多种致病菌的灭活中，其在食物中的残留将给人们的健康构成威胁，容易影响人体骨髓的造血功能，从而诱发个体罹患贫血；世界上多数国家已明令禁止在畜牧业中应用氯霉素，以免动物食源性吸收后循环至人体系统；我国也明确禁止将氯霉素作为兽药添加剂，且规定动物可食组织中不能存在氯霉素，这也是肉类食物质检的必检项[3]。牛奶作为人们日常的重要饮品，能够提供人体所必需的多种营养物质，备受人们的青睐，但牛奶中也有氯霉素残留的风险，威胁人体健康，因此有必要对牛奶中氯霉素检测方法进行研究。目前国内外针对氯霉素残留的检测尚未形成统一高效的检测方法，通常的检定方法包括：酶联免疫吸附检测法（ELISA）、放射免疫法、液相色谱法、气相色谱法、液－质联用法和气－质联用法等[4]。

本次试验采用HPLC－MS/MS对牛奶试样中的氯霉素进行测定，利用氯霉素易溶于乙腈的理化特性，将乙腈作为氯霉素的提取溶剂可充分发挥出乙腈对蛋白质类物质的清除能力。目前，食品质检部门对食物中氯霉素残留情况的测定分为以下几个步骤：首先利用乙酸乙酯对试样进行萃取，借助正己烷进行脱脂，之后再利用乙酸乙酯反萃取，最后采用氮气吹干定容。为了排除牛奶蛋白质的干扰，选取乙腈进行清除，通过乙酸乙酯萃取，旋转蒸发富集萃取液。试验结果表明，该处理方法的萃取效率高，且能保障牛奶中氯霉素的稳定性，有利于检测试验的顺利推进。

本文建立了HPLC－MS/MS测定牛奶中氯霉素的检测体系，明确了检测的操作流程，该方法重现性好，且受到的干扰少、萃取效率高、检出限值范围广，在实际样品测定中便于推广应用，为快速测定牛奶中氯霉素残留提供了技术方法。

参考文献：

[1]王安伟，刘天密，覃锐，陈建华.水产品中氯霉素残留检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2017，8（11）：4259-4264.

[2]高何刚.氯霉素残留的液相色谱质谱检测方法的样品前处理研究进展[J].广东化工，2017，44（08）：204-205.

[3]郭晓关，李俊.高效液相色谱-质谱法测定水中氯霉素效果分析[J].耕作与栽培，2016（06）：11-13.

[4]顾缨缨，吴宇伉，梅勇.高效液相色谱质谱联用法同时测定牛奶中氯霉素、甲砜霉素残留量[J].现代预防医学，2016，43（21）：3989-3992.