胰腺癌中miRNA基因序列变异的研究

朱政

（苏州大学附属第一医院腔镜病区江苏苏州215000）

【摘要】MicroRNAs（miRNA）是一类约20~22碱基大小的小分子非编码RNA。是一类新发现的在转录后水平负性调控基因表达的基因调控因子。miRNA在多种肿瘤中都存在表达异常。miRNA表达异常可能在胰腺癌的发生中起到了重要作用。本课题假设miRNA的基因序列在胰腺癌中存在变异，因此检测了8种miRNA在胰腺癌组织及肿瘤细胞株中前体的基因序列。总共发现了4种新的基因序列的变异。miRNA定量分析显示，miR-21在20例胰腺癌病例标本及6种肿瘤细胞株中均有显著的高表达。新发现的一个位于pre-miR-21基因下游29个碱基处的A-G突变导致了其附近二级结构的改变，并引起miR-21的相对低表达。这些结果显示miRNA可能在胰腺癌的发生中起到了重要的作用，但是其基因序列的变异引起表达异常的分子机制仍待进一步的研究。

【关键词】microRNA，胰腺癌，启动子，二级结构【中图分类号】R735.9【文献标识码】B【文章编号】1007-8231（2011）12-2265-03

前言

胰腺癌因为早期就会发生转移，病人就诊时往往已是晚期，并且对放化疗不敏感，是一种非常致命的疾病，预后很差［1,2］。经过数十年的研究，人们对胰腺癌发生的分子机制仍然所知甚少。因此，进一步研究与肿瘤的发生、发展有关的基因有助于我们诊断及治疗这种疾病。

一类新发现的小分子非编码RNA—microRNA（miRNA），可能会给肿瘤的研究带来新的认识。miRNA是一类20-22个碱基大小的小分子非编码RNA，在转录后水平负性调控基因的表达。它们结合到目标mRNA的3’非编码区后，通过分解mRNA或抑制其翻译来负性调控目标基因的表达。miRNA首先从基因组DNA转录为一个大分子转录子pri-miRNA，然后在细胞核内由Drosha酶加工成发卡结构的pre-miRNA。Pre-miRNA接着被Exportin-5转运至细胞浆内，由Dicer酶加工为成熟miRNA［3-5］。

目前的研究显示，miRNA可以起到类似肿瘤抑制基因或癌基因的作用［3］。miRNA在肿瘤中所起的作用，主要与其异常的表达水平有关。在胰腺癌及多种肿瘤中，miRNA的表达图谱已陆续有人报导［6-13］。

调控miRNA表达及成熟的确切机制尚不明确，但之前的研究提示了几种可能的机制，包括遗传学和表观遗传学的变异［14,15］。miRNA的基因突变，可能会对其转录、加工或是识别靶基因的过程产生影响［16］。本课题的目的是发现胰腺癌中miRNA的基因突变，并研究其功能。

1材料及方法

1.1材料

共收集了20例在2009年到2011年间在苏州大学附属第一医院接受手术治疗的胰腺导管腺癌患者的病例标本。包括肿瘤组织及周围正常胰腺组织。这些标本都是新鲜冻存，并经过病理学确诊的。同时收集了5例正常胰腺组织标本及7例健康人外周学基因组DNA标本。培养了6例肿瘤细胞株：BXPC-3、CFPAC-1、PANC-1及SW1990（胰腺癌细胞株）；MDA-MB-231（乳腺癌细胞株）；HEPG2（肝癌细胞株）。使用AxyPrepTMMultisourceGenomicDNAminiprep试剂盒提取DNA，Trizol提取RNA。

1.2检测miRNA的基因突变

首先参考了cDNA基因芯片数据［11-13］、aCGH数据［17-21］以及其他肿瘤的相关文献［6-10］，挑选出如下8种可能于胰腺癌有关的miRNA：miR-15a、miR-16-1、miR-21、miR-155、miR-196a-1、miR-196a-2、miR-219和miR-375。使用PCR扩增了每个pre-miRNA大约800bp长度的基因组片段（包括上游约500bp及下游约200bp）。此长度的基因组片段基本包括了miRNA基因的所有功能区域［22］。PCR引物序列及反应条件见表1。所有标本均送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.3TaqMan实时定量RT-PCR

采用实时定量RT-PCR检测miR-21的表达水平。首先使用TaqMan2ⅹUniversalPCRMasterMix,NoAmpEraseUNG试剂盒合成cDNA。再用TaqManmiRNAassays试剂盒检测成熟miRNA表达水平。使用RNU6B作为内参。所有的PCR反应都在Rotor-Gene3000real-timerotaryanalyzerPCR仪进行。每个标本都做双份反应体系。miRNA的相对浓度采用ΔΔCT计算。采用t检验分析miR-21在各样本中表达水平差异的显著性。

1.4预测miRNA前体的二级结构

使用RNAfold网站服务（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）预测pre-miRNA野生型及变异型序列最稳定的二级结构。分析的序列包括pre-miRNA及其上游约200bp、下游约100bp的基因序列区间。

2结果

2.1发现的miRNA基因序列变异

本实验检测了在20例胰腺癌病例标本及6株肿瘤细胞株中，8个miRNA的基因序列。在miR-21和miR-155中，总共新发现了4个序列变异（表2）。所有新发现的序列变异都经过了重复实验验证。在5例正常胰腺组织标本中，进一步检测了miR-21和miR-155的基因序列，结果未发现有相同的突变，提示这几种序列变异可能与胰腺癌有关。4个序列变异都位于pri-miRNA区域。

2.1miR-21在胰腺癌中的表达水平

6例肿瘤细胞株、19例胰腺癌组织标本、12例癌旁正常胰腺组织和4例正常胰腺组织的RNA被提取，用于检测miR-21的表达水平。结果显示，相对于正常胰腺组织，miR-21在肿瘤细胞株及胰腺癌组织中均为高表达（P<0.05；图1A）。这些数据和基因芯片检测的结果相符合［11-13］，提示miR-21可能起到了类似癌基因的作用。

2.2序列变异对miRNA前体二级结构的影响

在人体内，miRNA前体需经过RNA酶的加工处理，才能转化为有活性的成熟miRNA。miRNA在加工、成熟的过程中，需要其前体具有合适的二级结构及序列元件［15,24-26］。新发现的序列变异中，只有位于pre-miR-21下游29个碱基处的一个A-G序列变异改变了靠近其pre-miRNA发卡结构区域的二级结构（图2）。

3讨论

近来的研究都提示miRNA的序列变异及表达异常与肿瘤的发生发展有密切的关系。miR-16-1-miR-15a前体的一个基因突变被证实与家族性慢性淋巴细胞白血病有关［27,28］。miR-21在多种肿瘤中均为高表达，其异常升高的表达水平可能会直接抑制一个位于10号染色体上的重要抑癌基因的活性［6–13,29］。本课题证实了miR-21在胰腺癌组织中为高表达，提示miR-21可能在胰腺癌中起到了抑制凋亡的癌基因的作用。

使用RNAfold程序分析发现，在SW1990细胞株中miR-21的A+29G序列变异导致其发卡结构附近区域的二级结构发生了改变（图2B）。miR-21在该细胞株中的表达水平显著低于在其他肿瘤细胞株中的表达水平（P<0.05；图1B）。Calin等人曾报道过pre-miR-16-1的C+7T序列变异导致了成熟miRNA的相对低表达［27］。所发现的miR-21的A+29G序列变异的功能尚需进一步的研究。

本课题证实了miRNA在胰腺癌中存在基因突变以及miR-21在胰腺癌中相对高表达。所发现4个序列变异中的一个，能够改变miRNA前体的二级结构，并降低其表达水平。所有的结果都提示miRNA在胰腺癌的发生、发展中具有重要的作用。但是miRNA的基因突变影响其表达水平的分子机制尚待进一步的研究。

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表2胰腺癌组织及肿瘤细胞株中新发现的miRNA基因的序列变异

miRNA序列变异*突变位置标本miR-21A-233Gpri-miRNABXPC-3miR-21A+29Gpri-miRNASW1990miR-155C-62Apri-miRNASW1990miR-155A+59Gpri-miRNACase233*序列变异在pre-miRNA上游的标“-”；序列变异位于pre-miRNA下游的标“+”。