肠球菌致病因子及耐药性检测方法学的探讨

刘艳华

【摘要】开展对肠球菌致病因子和耐药性检测方法学的研究，对认识肠球菌的致病机理、预防院内感染、新药的研发以及临床合理用药都具有重要的指导意义。

【关键词】肠球菌致病因子耐药性检测方法

【中图分类号】R378.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）03-0379-02

近年来，肠球菌的院内感染、耐药菌株在逐渐增多，致病性也在逐渐增强，多重耐药明显，尤其是耐万古霉素的肠球菌的出现，使临床治疗陷入困境，因此对肠球菌的毒力因子及耐药性的检测方法的研究显得尤为重要。有了好的检测方法，才能进一步深入了解致病及耐药机制，从而为流行病学的调查及对抗肠球菌新药的研发提供理论依据。本文就肠球菌的毒力因子及耐药性的检测方法的研究进行综述。

1致病因子的实验室检测方法

1.1致病物质的检测[1]多用Western印迹杂交、ELISA、重组蛋白等方法检测致病物质及其功能。

1.2致病基因的检测[2]多用PCR、RT-PCR、斑点杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、基因测序和限制性内切酶酶切等方法检测致病基因的携带及表达调控。

1.3证实肠球菌毒力通过建立CBA小鼠尿道炎或大鼠腹膜炎、兔心内膜炎、兔内眼炎等动物模型、构建致病基因缺失或插入突变菌株、对不同标本、不同人群以及不同地区分离的肠球菌的表型和基因型进行比较，明确肠球菌的毒力。

1.4致病物质的表型检测

1.4.1细胞溶解素的表型检测细胞溶解素在含有人、马或兔血的琼脂平板上表现β溶血，但不能溶解羊血。因此，由于临床微生物检验多采用羊血制备血平板，常常会出现肠球菌溶血假阴性表型。

1.4.2肠球菌生物膜的表型检测肠球菌在聚苯乙烯表面和宿主粘膜上皮细胞表面形成生物膜，用相差显微镜可以看到由肠球菌菌体组成的生物膜，极难清除，给临床治疗带来很大困难。

1.4.3明胶酶的表型检测明胶酶可以酶解明胶，使之液化。将肠球菌接种在含3%明胶的Todd-Hewwit琼脂中培养、冷藏后，产生明胶酶的肠球菌菌落周围即出现浑浊的晕，此时若将Frazier液（氯化汞15克，浓盐酸20毫升，蒸馏水100毫升）倾倒在平板上即可在菌落周围观察到透明条带。

1.4.4聚集物质的表型检测肠球菌在信息素的诱导下发生聚集现象，并可以粘附于肾上皮细胞（Vero细胞）和肠上皮细胞（Caco-2细胞），用电

子显微镜即可观察到。

1.4.5胶原蛋白粘附素的表型检测表达胶原蛋白粘附素的肠球菌在

体外环境中可以与胶原蛋白Ⅰ发生粘附，促进感染发生，用酶联免疫吸附试

验、吸收光谱分析等方法可以观察到。

1.5巨噬细胞内存活试验肠球菌可以在宿主巨噬细胞内存活，逃避宿主免疫系统的清除作用。将肠球菌注入10周龄的BALB/c小鼠体内，4小时后腹穿提取巨噬细胞，加入抗菌素并放CO2环境培养以杀死胞外细菌，计数胞内存活菌，明确肠球菌在巨噬细胞内的存活状态。

2耐药性的检测

2.1体外敏感试验

2.1.1依据2009年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的纸片扩散法对万古霉素耐药的屎肠球菌进行药敏试验。

2.1.2按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）规定，用平皿2倍稀释法分别测定万古霉素、替考拉宁、氨苄西林、四环素、庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、氯霉素、红霉素和利福平等抗菌药物对肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)。

2.2质粒接合转移试验。

2.2.1液体接合实验

分别将供体菌和受体菌FA2-2和BM4105RF接种于BHI液体培养基中，37℃孵育过夜，按1:10混合，37℃孵育4小时以后，涂布于供体菌和接合菌在选择性固体培养基上（供体菌用含万古霉素选择性培养基，接合菌用含万古霉素、利福平和呋西地酸的BHI选择性培养基），37℃48小时观察结果，记录接合菌和供体菌的菌落数，计算转移频率（接合菌/供体菌）。

2.2.2滤膜结合试验

分别将供体菌和受体菌FA2-2和BM4105RF接种于BHI液体培养基中，37℃孵育过夜，按1:10混合，加压通过滤膜，将滤膜置于BHI培养基的表面，37℃孵育过夜，取滤膜置于BHI液体培养基1ml中，震荡洗涤后取菌液，按照10倍的稀释法分别均匀涂布于供体菌和接合菌用选择性固体培养基上（供体菌用含万古霉素选择性培养基，接合菌用含万古霉素、利福平和呋西地酸的BHI选择性培养基），37℃48小时观察结果，记录接合菌和供体菌的菌落数，计算转移频率（接合菌/供体菌）。

2.2.3质粒酶切图谱分析

将BHI液体培养基中，37℃培养过夜的菌液5ml，3000RMIN-1离心20分钟，收集沉淀菌体，用碱裂解法提取质粒；干燥后溶于TE中，经ECOR137℃孵育4小时以λDNA/HindIII为分子量标准，0.8%琼脂糖凝胶中50V电泳3小时后，0.5µ/ml溴化乙啶染色25分钟，用凝胶成像系统观察结果。

2.3PCR方法检测接合子耐药基因。

3肠球菌导致疾病和耐药的原因及临床意义

3.1当抗菌素大量使用或宿主免疫力低下时，宿主与肠球菌之间的共生状态失衡，肠球菌离开正常寄居部位进入其它组织器官，首先它在宿主组织局部聚集达到阈值密度，然后在粘附素的作用下粘附于宿主细胞的胞外矩阵蛋白，分泌细胞溶解素、明胶酶等毒性物质侵袭破坏宿主组织细胞，并通过质粒接合转移使致病性在肠球菌种间扩散，并耐受宿主的非特异性免疫应答，引起感染性疾病的发生发展。

3.2肠球菌耐药的主要原因是由于病菌的变异及抗生素使用不当造成的。耐万古霉素肠球菌的增多不单是由于万古霉素等糖肽类药物的选择性的压力所致，另一个重要的原因肠球菌所具有的基因水平转移系统，基因的水平转移造成了耐药基因在细菌间的转移，通过基因重组造成了细菌耐药性的增加。

4结语与展望

随着检测方法学研究的不断深入，肠球菌的致病及耐药性的机理会更加清晰，有望解决肠球菌治疗难题，对抗危害人类健康的强大杀手——肠球菌的新药的研发将指日可待。

参考文献

[1]DupreI,ZanettiS,SchitoAM,etal.IncidenceofvirulencedeterminantsinclinicalEnterococcusfaeciumandEnterococcusfaecalisisolatescollectedinSardinia(Italy).JMedMicrobiol,2003,52(6):491-498.

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