骨伤洗剂微生物限度检查法适用性试验研究

(整期优先)网络出版时间:2019-11-22
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骨伤洗剂微生物限度检查法适用性试验研究

巫繁菁韦玮唐林姚金娥(通讯作者)

(广西骨伤医院药剂科广西南宁530012)

【摘要】目的:建立骨伤洗剂微生物限度检查方法。方法:根据骨伤洗剂的用药途径和制法,按照2015年版《中国药典》四部规定对其进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定,及控制菌的检查。结果:确定采用稀释法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定,采用常规法进行控制菌的检查。结论:建立的微生物限度检查方法合理可行。

【关键词】骨伤洗剂;微生物限度检查方法;适用性实验研究

【中图分类号】R917【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2019)24-0246-02

我院骨洗方从上世纪80年代末沿用至今已有近三十年,方含桂枝、荆芥、紫草等七味中药,具有祛风通络、消炎、消肿止痛的功效,用于风湿肿痛、软组织损伤等骨科疾病,属外用制剂,禁内服。根据骨洗方使用特点将骨洗方经水提取而成骨伤洗剂,合约0.55g生药材·ml-1,本文按照2015年版《中国药典》四部的规定[1]对骨伤洗剂进行微生物限度检查法适用性实验研究,结果稳定可行,该方法可用于骨伤洗剂的微生物限度检查。

1.仪器与材料

1.1仪器

生物安全柜(HR40-ⅡA2,青岛海尔特种电器)、生化培养箱(DNP-9162,上海比朗仪器)、全自动压力灭菌器(LMQ.C-80E,山东新华医疗器械)、电热恒温干燥箱(FY-SY-4,吴江富宇烘箱设备)、电冰箱(LG4-688,广州施乐华)、微波炉(EM-3011EB1,合肥三洋荣事达)、恒温水浴箱(HH-8,常州中捷实验)、电子天平(TP-3102,感量0.1g,赛多利斯)、涡旋振荡器(maximixⅡ,ThermoScientific)、气浴恒温振荡器(ZD-85,金坛市精达)。

1.2培养基

沙氏葡萄糖液体培养基(批号:150821)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA,批号1709152)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号170103)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号170509),北京三药科技开发公司提供。胰酪大豆胨液体培养基(TSB,批号20171212),青岛海博生物技术有限公司提供。沙式葡萄糖琼脂培养基(SDA,批号1064381),广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3供试品

骨伤洗剂(规格:500ml/瓶,批号:20180408,20180409,20180410,广西骨伤医院提供)。

1.4菌种

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[GDMCC1.220](中国工业微生物菌种保藏管理中心)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003](中国医学细菌保藏管理中心)、枯草芽孢杆菌(BacillusSulticis)[CMCC(B)63501](广东环凯微生物科技有限公司),白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspeigillusniger)[CMCC(F)98003](中国食品药品检定研究院)。以上菌种均为第五代。

2.方法与结果

2.1菌液制备

将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌在33℃的TSB中培养24h,白色念珠菌在25℃的SDB中培养24h,黑曲霉在25℃的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养7d,然后分别用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为1000~10000cfu·ml-1的菌悬液,备用。

2.2供试液制备

取供试品,混匀,作为供试液。取供试液10ml,加入45℃的TSB至100ml,作为1:10供试液。

2.3微生物计数法建立及回收率实验

2.3.1常规法实验组:吸取5份供试液,每份9.9ml,分别加入0.1ml实验菌液,使含菌量为10~100cfu·ml-1,混匀后吸取1ml置平皿中,倾入TSA,每株实验菌平行制备2个平皿,另从加入真菌的供试液吸取1mL置平皿中,倾入SDA,每株真菌平行制备2个平皿。菌液对照组:取TSB5份,每份9.9ml,分别加入0.1ml实验菌液,摇匀后吸取1ml至平皿中,倾入TSA,每株实验菌平行制备2个平皿,另从加入真菌的TSB吸取1ml置平皿中,倾入SDA,每株真菌平行制备2个平皿。供试品对照组:吸取4份供试液1ml至平皿,2份倾入TSA,2份倾入SDA。稀释剂组:吸取4份TSB1mL至平皿,2份倾入TSA,2份倾入SDA。

回收率计算方法:回收率=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/(菌液组平均菌落数-稀释剂组平均菌落数)

2.3.2稀释法(1:10)实验组:取供试液(1:10)进行实验,其余操作同常规法。菌液对照组:操作同常规法。供试品对照组:取供试液(1:10)进行实验,其余操作同常规法。稀释剂组:同常规法。

回收率计算方法:同常规法。

2.3.3微生物计数法及回收实验结果由微生物计数法及回收率实验结果可知,需氧菌总数、霉菌和酵母菌的总数测定采用常规法不可行,而采用稀释法回收率均在0.5~2之间,表明稀释法可行,见表1、表2。

表1霉菌及酵母菌的回收实验比值测定结果

2.4控制菌检查法适用性实验

2.4.1菌悬液制备取2.1项下含菌量为1000~10000cfu·ml-1的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至含菌数为10~100cfu·ml-1的菌悬液,备用。

2.4.2金黄色葡萄球菌供试品组:取1:10供试液10ml接种至100mlTSB中,33℃培养24h。阳性对照组:取含菌量为10~100cfu·ml-1的菌液1ml加入100mlTSB中,于33℃培养24h。阴性对照组:取稀释液10ml加入100mlTSB中,于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板,33℃培养24~48h。

2.4.3铜绿假单胞菌供试品组:取1:10供试液10ml接种至100mlTSB中,33℃培养24h。阳性对照组:取含菌量为10~100cfu·ml-1的菌液1ml加入100mlTSB中,于33℃培养24h。阴性对照组:取稀释液10ml加入100mlTSB中,于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板,33℃培养24~48h。

2.4.4控制菌检查验证结果控制菌检查验证结果见表4。

表4控制菌检查方法的适用性实验结果

3.讨论

骨伤洗剂药物组成中含有挥发性成分的桂枝、荆芥,紫草以及少量的聚山梨酯80和苯甲酸钠,这些成分对金黄色葡萄球菌等有一定的抑制作用[2-6],常规法实验结果表明骨伤洗剂对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及枯草麦芽杆菌有一定的抑制作用,所以选择采用稀释法(1:10)来降低和消除减弱骨伤洗剂中的抑菌物质对氧菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用,微生物计数法三次验证实验回收值均在0.5~2之间,说明方法可行,可用于骨伤洗剂的微生物限度检查。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:25

[2]万里江,范正达,唐风雷,等.桂枝挥发油的提取及抗菌实验的考察[J].海峡药学,2008,20(12):32-34

[3]解宇环,沈映君.荆芥挥发油抗炎作用的实验研究[J].中国民族民间医药,2009,18(11):1-2

[4]黄贵莲,周月广,金鑫,等.紫草素体外抗菌活性的实验研究[N].三峡大学学报(自然科学版),2017,6(39):8-10

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[6]胡春红,葛红莲,李季平,等.苯甲酸钠对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的影响[J].食品工业科技,2011(4):180-181

基金项目:广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项,项目编号:GZZJ14-12。

作者简介:巫繁菁,女,硕士研究生,主管中药师,主要从事医院制剂开发。

通讯作者:姚金娥,女,副主任药师,主要从事药事管理和医院制剂开发。