中药暴马子遗传毒性的研究

李雷夏俊伟黄红兰

关键词：暴马子;环磷酰胺;抗诱变;微核试验

StudyontheGeneticToxicityofSyringareticulatavar.amurensis

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethegenotoxicandanti-mutationeffectofSyringareticulatavar.amurensis.MethodsThemicronucleustestofmousebonemarrowcell(MNT)wasused.ResultsTherewasnosignificantdifference(P>0.05)resultsSyringareticulatavar.amurensiseachdosegroup(3.0,6.0,12.0g/kg)inducedmicronucleirateandthenormalcontrolgroup;Syringareticulatavar.amurensiseachdosegrouponcyclophosphamide(CP)bymicronucleusratesinducedinhibition(P<0.05),inwhich6.0g/kgdosegroupofCP-inducedmicronucleiratesignificantlyinhibited.ConclusionSyringareticulatavar.amurensisitselfhasnomutageniceffectsongeneticmaterial,atacertaindose,withastronganti-mutageniceffect.

[Keywords]Syringareticulatavar.amurensis;CP;Anti-mutation;Micronucleus

随着工农业生产的不断发展,生态环境有逐渐恶化的趋势,人类的健康日益受到肿瘤等疾病的困扰。研究表明,肿瘤的发生、人体的衰老等和正常细胞的染色体突变有密切联系,因此,应用抗突变剂降低人体正常细胞的突变率,对于肿瘤的防治和延缓衰老有着特殊的意义[1]。暴马子(Syringareticulatavar.amurensis)，别名暴马丁香，暴马丁香花序大，花皆白，浓郁芳香，花期长，抗逆性强[2]。暴马丁香为木犀科丁香属落叶灌木或小乔木,别名暴马子皮、白丁香,其树皮、树干及枝条被称为暴马子皮，具清肺祛痰、止咳消炎、利水。常用于慢性支气管炎、咳嗽、咯痰、支气管炎、支气管哮喘和心脏性浮肿等症的治疗。暴马丁香分布于我国东北、内蒙古、华北和西北等地区。是临床常用中药。但关于暴马子的遗传毒性研究尚未见报道,为进一步了解暴马子对遗传物质的影响，对暴马子进行了诱变和抗诱变的研究。微核实验能够检测染色体完整性的改变及染色体的分离改变两种遗传学终点，因其具有稳定、灵敏的特点而得到广泛应用[3]，是观察染色体损伤的简单可靠方法，是遗传毒理实验常用的细胞遗传学方法之一[4-5]。一定剂量的环磷酰胺可导致仔猪生长性能降低，改变免疫细胞浓度。能改变机体白细胞和淋巴细胞浓度，抑制T细胞的成熟、增殖与分化，具有免疫抑制作用，能构成免疫抑制模型[6]。因此，本实验采用小鼠骨髓细胞的微核率作为指标来探讨暴马子香对环磷酰胺引起的小鼠遗传损伤的影响。

1材料和方法

1.1实验动物昆明小鼠（18~20g），雌雄各半。

1.2实验药品暴马子水提取物:称取暴马子12g粉碎。300ml蒸馏水浸泡1h,反复煎煮3次，每次30分钟。混合3次滤液,按所需剂量浓缩成所需的浓度，4℃保存。试验前以无菌生理盐水稀释。环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)，上海华联制药有限公司生产。

1.3实验动物分组及剂量设计实验动物随机分组:阴性对照组(N.S),阳性对照组(CP,30mg/kg)，暴马子诱变组(低剂量3.0、中剂量6.0、高剂量12.0g/kg),暴马子抗诱变组(暴马子各剂量+CP30mg/kg)。暴马子水提液经灌胃给药。CP腹腔注射。,每只小鼠计数2000个嗜多染红细胞(PCE)，求出嗜多染红细胞含微核(MN)的千分率。

1.4实验方法暴马子诱变组低、中、高3个剂量组动物分别灌胃给予相应剂量的暴马子水提取液，暴马子抗诱变组低、中、高、3个剂量组动物分别灌胃给予相应剂量的暴马子水提取液和CP30mg/kg，阳性对照组经口灌胃给予环磷酰胺（30mg/kg），阴性对照组给予生理盐水。

1.5标本制备取股骨，用注射器取小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定5-10min。将固定好的涂片放入盛有Giemsa应用液的染缸中，染色10-15min，取出后立即用pH值=6.8的磷酸盐缓冲液冲洗、晾干，保存于阴凉干燥处。

1.6阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，在油镜下观察嗜多染红细胞，用双盲法阅片，每只动物计数2000个嗜多染红细胞，观察含有微核（多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20-1/5）多染红细胞数，微核率以千分率表示。

2.结果

2.1暴马子的诱变作用微核实验结果显示(表1)3个剂量组的暴马子单独使用时,微核率与空白对照组比较均无显著性差异(P>0.05),差别不具有统计学意义，说明在所给予的实验剂量下，暴马子本身对小鼠骨髓细胞染色体无断裂效应，对纺锤体无毒效应，提示暴马子本身对小鼠体细胞无诱变作用。

表1GenetoxieeffectofSyringareticulatavar.amurensis

Group

Dose

(WB/g·kg-1)

No.of

MNPCEFrequencyof

MN(‰)

N.S-262.60±1.15

Syringareticulatavar.amurensis3.0292.90±0.61

6.0333.30±0.57

12.0313.10±0.51

CP3x10-217017.00±4.89

2.2暴马子对CP诱发微核率的影响实验结果显示(表2),暴马子与CP合用时,微核率与空白对照组比较有差异(P<0.05),差别具有统计学意义，各剂量组对CP诱发的微核均有抑制作用，其中6.0g/kg剂量组抑制效果较为显著。

表2InfluenceofSyringareticulatavar.amurensisonCP-inducedMN

Group

Syringareticulatavar.amurensis

(WB/g·kg-1)

No.of

MNPCEFrequencyof

MN(‰)

N.S-262.60±1.15

CP(WB/mg·kg-1)30

3.012012.00±2.14

306.0878.70±1.53

3012.011111.10±1.19

CP30-17017.00±4.89

3讨论

随着医学科学的发展,传染病已初步得到控制。但是,由于环境污染、非传染病性疾病特别是恶性肿瘤的死亡率在逐年上升。目前认为,约80%的肿瘤是由环境因素引起的。尽管发生机制目前沿不完全清楚,但是“诱变剂→基因突变→癌变”这一学说可解释多种肿瘤的发生,并被多数学者所公认[12]。因此,灭活诱变原或防止基因突变是预防肿瘤的关键。

微核的形成或者异常增多提示了染色体的损伤，因此微核试验广泛应用于药品、化妆品、保健食品以及环境检测过程中遗传毒性实验评价[7]。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测方法，是目前应用较广的一种微核观察手段，有些国家和国际组织将其规定为评价新药、食品添加剂、农药等化合物毒理安全性的必做指标之一[8]。

环境诱变剂能直接或间接作用于DNA分子,从而干扰或破坏DNA的复制或修复过程,引起DNA分子损伤,并可进一步诱发基因突变或染色体畸变,引起疾病和肿瘤的发生[3]。抗诱变剂的应用可以阻断或拮抗诱变剂对遗传物质的损伤[9]。因此对诱变剂的检测及抗诱变剂的筛选十分重要。在诱变性短期检测体内试验中,微核试验有良好的剂量效应关系,阳性检测率优于染色体畸变法,而假阳性又明显低于SCE[10]。

暴马丁香俗称暴马子，木犀亚科丁香属落叶大灌木或小乔木,主要分布于我国长白山和小兴安岭林区,暴马丁香花、树叶、树皮及树根均可入药,具有清热解毒、镇咳祛痰、消炎利尿等功效。暴马丁香制品芩暴红止咳片及胶囊有很好的治疗效果[11]。

本文以注射环磷酰胺小鼠为模型，研究了暴马丁香的诱变性和对CP诱发遗传损伤的拮抗作用。结果表明,对不同剂量暴马丁香提取物治疗小鼠骨髓细胞微核发生率进行比较，注射环磷酰胺对照组微核率为17.0‰，与正常对照组2.60‰，低、中、高3个剂量组微核率分别为2.90‰，3.30‰，3.10‰，与正常对照组相比无明显差异，说明在所给予的实验剂量下，暴马丁香对小鼠骨髓细胞染色体无断裂效应，对纺锤体无毒效应，暴马丁香本身对小鼠体细胞无诱变损伤作用。暴马丁香与CP同时作用于小鼠时,在一定剂量时有明显的抑制遗传损伤作用(P<0.05)。能明显降低小鼠骨髓细胞微核发生率，对环磷酰胺诱导的遗传损伤具有一定的保护作用。这提示我们,暴马丁香这种资源丰富，应用广泛的中草药,不但能在慢性支气管炎等症中发挥其疗效,还可以充分发挥其抗诱变作用,对诱变剂所致遗传物质损伤起到一定的防护和抑制作用。

4参考文献

[1]沈建伟,王明艳.两种中药复方拮抗环磷酰胺致突变作用的研究[J]，癌变，畸变，突变，1999，11（1）；38-39.

[2]李幼平．暴马丁香播种繁殖及三种树形的大苗培育技术[B].中国林副特产，2018，26（3）：170-209

[3]余明泽，刘以农，蒋中仁，等．环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核的影响因素的研究[J]．现代预防医学，2007，34(5):935-936

[4]郑巧玲，梁丽燕，陈润涛，等．职业小剂量照射对医用X射线工作者微核产额影响的研究[J]．现代预防医学，2006，33(12):2297-2298

[5]汪旭，刘素清，合正基，等．抗着丝点抗体在鉴别微核起源上的应用[J]．癌变·畸变·突变，1994，6(2):37-41

[6]钟金凤，伍维高，吴支要，等．应用环磷酰胺构建断奶仔猪免疫抑制模型［J］．江苏农业科学，2018，46(9):180－183．

[7]曲见松，袁敬清，赵艳霞，范治云，祝清芬,微核试验方法的研究进展[A].药学研究,2017,36(10)：534-594

[8]MichelleA，LenitaC，RicardoA，etal.AntimutagenicityofrosmarinicacidinSwissmiceevaluatedbythemicronucleusassay[J].MutatRes，2008，657（2）：150-154

[9]赵寿元.人类遗传学概论[M].上海:复旦大学出版社，1996：199.

[10]薛开先.遗传毒理讲座[J].癌变、畸变、突变，1995，7(2)：124～128.

[11]解爱林.暴马丁香利用价值及其产业发展对策[J].特种经济动植物，2013，11：40-41.

[12]夏世钧,吴中亮.分子毒理学基础[M].武汉:湖北科学技术出版社,2001.133-136.