肝内胆管结石合并肝内胆管癌中E-cadherin的表达及其意义

李丹1,2胡荍1,2刘涛2汤显斌2朱润庆1

（1武汉大学基础医学院病理与生理学系430071）

（2湖北医药学院附属太和医院病理科湖北十堰442000）

【摘要】目的探讨肝内胆管结石合并肝内胆管癌中E-cadherin的表达及其临床病理联系的意义。方法我们对30例诊断为肝内胆管结石合并胆管癌的病人进行研究，采用免疫组化法检测E-cadherin的表达，并选取9例肝胆管结石病例和4例正常胆管病例作为阳性对照。结果胆管癌细胞中E-cadherin的低表达率为70%（21/30），胆管结石细胞中低表达率为33.3%(3/9)，正常胆管细胞中低表达率为0(0/4)，三者相比较差异有统计学意义（P<0.05）。且在肝胆管结石合并胆管癌患者中，E-cadherin的低表达率与分化程度(P=0.023)和淋巴结转移情况(P=0.014)有关，而与年龄和性别等因素无关（P>0.05）。结论E-cadherin的低表达在肝内胆管结石所致肝内胆管癌中起着重要的作用，其低表达率与肿瘤的恶性程度和转移密切相关。

【关键词】肝内胆管结石肝内胆管细胞癌E-cadherin

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）15-0083-02

肝胆管癌是一种预后较差的高度恶性肿瘤。本病发病隐匿，经根治性手术后五年生存率≤30%[1-3]，其发病率近年来有逐渐增高的趋势。其主要发病机制和病因学原因尚未明确，所以研究肝胆管癌细胞侵袭转移的分子机制，寻找出早期控制胆管癌侵袭转移的途径就成为防治胆管癌的关键之一。据统计，大约有1/3的胆管癌患者合并胆管结石，而胆管结石中5％～10％将发生胆管癌[4]。我国是肝内胆管结石高发区，长期肝内胆管结石并蛋白发胆管癌的发生率约为3．6％～10％[5]。E-钙粘蛋白是一类分布于胚胎和成熟组织上皮的钙依赖性单次跨膜糖白，大量研究证明其表达的缺失参与肿瘤发生发展的整个过程。在一些低分化的或者晚期的肿瘤中，质膜上的E-钙粘蛋白表达量明显降低[4,6,7]。肝内胆管结石可造成胆道梗阻，引发反复胆道感染、炎症刺激和结石损伤，促使胆管上皮增生、不典型增生，进而导致其发生癌变。故本研究旨在探讨E-cadherin在胆管结石导致胆管癌慢性进展中的表达情况，探讨其所致的癌变过程中的临床意义。

1一般资料

在湖北医药学院附属太和医院病理科和病案室进行资料收集，通过查找病人的病理报告记录和病案记录了解病人的年龄、性别、既往病史和病理特征等。经过筛选后，共选取1999年1月-2012年1月30例经手术切除诊断为肝内胆管结石合并胆管癌患者在病理科存档的石蜡块，其中包括男17例，女13例，年龄45-78岁，平均52.1±10.1岁。另外选取9例胆管结石患者（男4例，女5例）年龄35-72，平均48.1±9.8岁。4例正常胆管上皮作为对照组，男2例，女2例。肿瘤大小直径1-15.cm，平均4.95cm。胆管癌组所有患者术前均未接受放疗、化疗及抗炎治疗。正常胆管组肝内胆管组织在光学显微镜下证实无炎症、结石、纤维化、不典型增生和癌变等病理改变。

2实验方法

2.1材料与试剂

E-cadherin兔抗人单克隆抗体,SP免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自福州迈新生物科技有限公司。

2.2免疫组化方法

采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP法)染色检测肝内胆管上皮细胞

E-cadherin的表达。将所有手术后取得标本10%甲醛固定，脱水后石蜡包埋，石蜡组织块切片4μm薄片，切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化后，过氧化酶阻断剂室温孵育10min(湿盒内)，PBS漂洗，5min×3。切片在PH6.0枸橼酸抗原修复液中行高压修复3min。非免疫山羊血清封闭，室温孵育10min(湿盒内)；倾去血清勿洗，加E-cadherin工作液，4℃过夜(湿盒内)；PBS漂洗，5min×3；滴加二抗（生物素标记的羊抗鼠/兔IgG）37℃孵育30min；PBS漂洗，5min×3；滴加三抗(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶)37℃孵育30min；加DAB显色；镜下观察，清水漂洗3次后，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。PBS缓冲液取代一抗作阴性对照，已知阳性组织切片作阳性对照。

2.3免疫组化结果评定

E-cadherin染色后细胞膜/胞浆可显示棕黄色颗粒。评定结果采用半定量方法,首先以染色强度打分：细胞无着色，0分；胞膜着色为浅黄色，1分；胞膜着色为棕黄色，2分；包膜着色为棕褐色，3分。其后评价细胞阳性率：每张切片随机选10个高倍视野，计数每个视野中细胞阳性细胞所占的百分比，分为4个等级：阳性细胞所占百分比小于5%为阴性(－)，计0分；阳性细胞所占百分比在6％～35％为弱阳性(+)，计1分；阳性细胞所占百分比在36％～70％为中等阳性(2+)，计2分；阳性细胞所占百分比大于70％为强阳性(3+)，计3分。每例标本的积分为以上两个参数之和，若结果≤3分为低表达。

2.4统计学方法

采用spss18.0进行统计学分析，计量资料采用x±s表示并进行方差分析，计数资料采用四格表x2检验或Fisher精确概率检验,以P,0.05为差异有统计学意义。

3结果

光学显微镜下可见胆管癌腺体呈不规则生长，被覆粘液柱状上皮，细胞异型性明显。

3.1E-cadherin在胆管组织中的表达

免疫组化染色后镜下观察各种胆管切片E-cadherin的表达情况，在正常胆管组织上皮细胞顶膜侧表达明显（呈棕褐色）。在胆管结石组织中上皮表达较少，染色较浅（棕黄色）。在胆管癌组织上皮顶膜侧表达很少或者缺失，见图1。在30例肝胆管癌患者中，有23例低表达，9例肝胆管结石患者中，3例低表达。4例正常单管组织中，0例低表达。在肝胆管癌组与结石组，结石组与正常单管细胞组，差异均有统计学意义，P<0.01，结果见表1。

图1.A、E-cadherin在正常胆管内，包膜阳性染色B、E-cadherin在肝内胆管结石胆管上皮中，胞膜着色，局部着色变浅淡C和D、E-cadherin在肝胆管癌细胞着色，肿瘤细胞中见少量着色，包膜阳性染色区明显减少，着色明显变浅，局灶着色微弱

表1E-cadherin在各种组织中的表达情况

3.2E-cadherin在肝胆管结石合并胆管癌患者中的表达与临床病理联系

E-cadherin的低表达与胆管癌的分化程度（P=0.023）和淋巴结转移情况（P=0.014）有关，差异有统计学意义，而与性别和年龄等因素无关，统计学分析其差异无统计学意义。

表明随着肿瘤的恶性程度的增加，E-cadherin的表达量减少，见表2。

表2E-cadherin的表达与肝胆管结石合并胆管癌临床病理联系特点

4讨论

肝胆管癌是一种起源于胆管上皮组织的高度恶性的肿瘤，由于其广泛的局部转移和频繁的淋巴转移使得其预后很差。尽管其诊疗水平在不断提高，但是其分子和遗传机制目前尚未明确。在此过程中癌细胞向邻近组织侵袭性生长是肿瘤转移的起始步骤,研究报道肿瘤的侵袭性生长与细胞之间的粘附功能异常以及建立起有利于癌细胞移动的再极化状态有密切关系[8]。近年来有关肿瘤的侵袭和极性改变的蛋白研究较为热门，其中研究较多的是一类广泛分布于胚胎和成熟组织上皮组织介导细胞间粘附的钙依赖性单次跨膜糖蛋白—E-cadherin，其在胚胎发育和肿瘤的发生期间的Wnt信号通路中以及细胞间的粘附作用都起着重要的作用[9]。在生理状态下，它对于提高细胞间的粘附作用和维持细胞结构的完整性和极性都相当重要。在许多肿瘤中E-cadherin低表达会使细胞间的粘附能力下降从而导致肿瘤细胞更易侵袭和转移[10]。通过本次研究我们发现E-cadherin的低表达与其肿瘤分化程度和淋巴转移倾向密切相关，但是对于临床病理的特征如性别、年龄等无相关性，这些研究结果与国外一些报道基本一致[11]。E-cadherin在肝胆管结石合并肝内胆管癌患者和胆管结石患者的表达均降低，在正常单管细胞中表达正常。可能在慢性胆管结石患者组织中，随着炎症加重，导致胆管粘膜上皮细胞破坏，极性受损，E-cadherin的低表达更加是细胞骨架与极性丧失，从而导致细胞异性变和过度增殖，从而参与肿瘤的发生发展。本次研究还通过免疫组织化学方法进行E-cadherin表达量的检测，结果显示在肝内胆管肿瘤细胞中E-cadherin表达量最低，胆管结石次之，而正常胆管细胞中E-cadherin表达量正常，且在胆管癌患者中阴性表达率最高，正常胆管细胞无阴性表达。这些结果都充分显示E-cadherin在正常细胞间极性和粘附起着重要作用，正是由于E-cadherin在肿瘤细胞中的过低表达，使得肿瘤易于发生转移。而慢性的炎症可能会导致细胞破坏和E-cadherin的进一步减少，从而导致肿瘤的转化。

综上研究所述，本研究证明E-cadherin在肝内胆管结石合并胆管癌和胆管结石患者中表达均降低，而且E-cadherin的低表达率与肿瘤的分化及是否发生转移有关。这些均为胆管结石患者的诊断和判断预后提供了依据，为抗癌的研究提供了新的思路。

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