高通量原位杂交新技术及其在 HER２基因 CISH法检测中的应用

丁晓昆，耿琍 *，张东明

摘要　目的：创立一种高通量原位杂交技术以提高检测效率和减少试剂用量，以解决当前原位杂交技术临床应用费用高通量低的痛点。方法：将待检组织细胞样品制备成薄膜载片放入微孔板中，在定制的微孔板杂交仪中完成杂交反应。结果：通过对乳腺癌和肺癌HER２基因的检测证实了该方法经济高效结果可靠。结论：采用薄膜载片微孔板检测系统进行高通量原位杂交可以将１２个载玻片的杂交仪的检测通量提高至１９２个，同时单个样本节省８０％的试剂用量。

原位杂交技术(in situ hybridization，ISH）在生命科学领域应用广泛，尤其在药物靶点检测和遗传病诊断等方面具有重要的应用价值，被公认为靶向治疗基因靶点检测的金标准。但由于原位杂交所用的分子探针价格昂贵和现有原位杂交仪检测通量低，并且操作步骤繁杂，临床上往往并不作为药物靶点检测的首选方法。为此，我们研发了高通量的原位杂交检测系统，在提高检测效率的同时降低了检测成本，并在肿瘤组织HER２基因靶点的检测中得到了验证。

用于肿瘤组织药物靶点检测的原位杂交技术，根据其信号发生原理的不同，目前主要分为荧光原位杂交（FISH），显色原位杂交（CISH）和银染原位杂交（SISH）三种。以HER2基因靶点检测为例，FISH法HER2检测临床已应用多年，积累了比较多的案例和数据，检测结果准确性高和重复性好，故被确定为金标准。为了验证我们高通量原位杂交技术的实际效果，我们选用经过FISH法检测过HER２基因靶点的乳腺癌和肺癌病理样本79例，采用薄膜载片微孔板高通量技术通过CISH法复检上述肿瘤组织HER２基因的扩增情况，以检验本系统的实际应用效果。现将高通量原位杂交新技术及其检测结果报告如下。

材料与方法

１.１实验材料　选择浙江省宁波市第六人民医院病理科经过FISH法检查过的乳腺癌和肺癌石蜡病理组织块，用透明耐高温的塑料薄膜作为组织切片的载体，捞片之后脱蜡水化，HE染色后镜下选取乳腺浸润性导管癌患者肿瘤细胞浸润部位进行标记，然后用特制的打孔器取下被标记的圆形组织片，放入定制的多孔板中。

１.２实验方法　仪器和试剂　１）HER２／ＣＥＮ１７双显色分子探针购自ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ　ＧｍｂＨ公司，与HER２基因杂交最后显深绿色，与ＣＥＮ１７杂交的显浅红色。２）高通量原位杂交仪由宁波吉聚生物科技有限公司生产。观察实验结果所用的光学显微镜型号为OｌｙｍｐｕｓＣＸ３１。

１.３实验步骤　 杂交前： 1）薄膜组织切片的制备：选用耐高温不变形的塑料薄膜作为组织切片的载体，捞片后进行烤片70℃x10min; 2）脱蜡和水化：组织切片依次放入二甲苯（xylene2x5min）和梯度酒精（100%乙醇 x5min, 9０%2x5min,70%2x5min;）。3)过氧化氢灭活内源性酶3%H2O2x5min; 4) 蒸馏水洗 3遍； 5) EDTA杂交前处理液x15min；6) 立即蒸馏水洗 3遍。7）加胃蛋白酶消化液于组织切片上，室温中3-10 min（保湿条件）；8） 蒸馏水洗 3遍；9） 70%，90% 和100%乙醇X1min；空气中晾干。杂交过程　1） Vortex（混悬震荡） 探针工作液，加５微升原位杂交探针工作液于癌组织切片上，充分覆盖组织，避免气泡；

杂交过程：置高通量原位杂交仪上微孔板中，设置80℃X5ｍｉｎ 37℃Ｘ１２小时过夜；杂交后： １）次日备2缸 SSC冲洗液，其 中 1缸预热至 80℃， 先用室温 SSC冲洗液，再用预热SSC冲洗液浸泡组织杂交片 5mi n；２）蒸馏水洗2x1min； ３) 1x TBS缓冲液（0.025％Twee n20 ／ PBS）洗3遍；封闭液封闭组织杂交片 1 0 mi n; ４) 滴加 鼠抗地高辛DIG/兔抗DNP抗体（一抗）工作液１0微升/片 ，37℃x30min或室温60min； ５）TBS洗 3遍；６）滴加 HRP/AP标记的抗鼠和抗兔抗体（二抗）混合工作液37℃x15min或室温 30 mi n；７）孵化期间将AP-Red A（30微升） 和 AP-Red B（970微升）混合（避免强光）待用；

８）TBS3x1min冲洗;　 ９) AP-Red 混合液室温10min;1０）孵化期间将HRP-GreenA（40微升） 和 HRP- GreenB （960微升）混合（避免强光）待用； 1１) 蒸馏水洗2x1min；1２) HRP-Green 混合液切片上室温10min； 1３) 蒸馏水洗2x1min； 16) 核绿（Nuclear Blue）染液 2min； 1４) 流水洗2min; 1５） 封片； 1６）光镜下观察计数。　　

检测结果判断标准：选择细胞核大小一致无重叠，且边界完整信号清晰的浸润癌细胞进行计数，随机计数３０个浸润癌细胞核的双色信号，其中绿色信号代表HER２基因，红色信号代表CEN１７；计算这些细胞核中绿色信号之和与红色信号之和的比值，若比值大于２则结果为阳性，表明肿瘤组织HER２基因扩增；若比值小于２但平均每个癌细胞HER２绿色信号计数大于／等于６亦为阳性。

若绿色信号之和与红色信号之和的比值小于２且平均癌细胞HER２绿色信号数小于２则为阴性，表明组织细胞没有HER２基因的扩增；若比值小于２，平均癌细胞HER２绿色信号数介于４－６之间，则需另外计数３０个浸润癌细胞重新进行统计。然后对结果进行最终判断。

结果和讨论　　

结果: 在50例FISH法HER2检测阳性的肿瘤组织标本中, 经高通量CISH法复检发现有49例CISH呈现HER2基因高倍扩增,仅1例显示无扩增;CISH法与FISH法在HER2基因扩增的检测上符合率为98%。另29例FISH检测HER2表达为阴性的标本中，经高通量CISH复检HER2基因扩增情况与FISH符合率为100%。高通量CISH与FISH的总体符合率为 98.7%,与国外文献报道（1.2），CISH与FISH的检测结果的整体符合率为96%的结果相近似, 可见高通量CISH法是检测HER2基因扩增的一项实用可靠的新技术。二者明显相关(P<0.001)。结论:采用高通量原位杂交仪进行CISH法检测乳腺癌HER2基因扩增的结果与FISH法检测的结果符合率高度一致。与以往的检测方法相比，高通量原位杂交检测技术单次检测通量增加16倍，单个样品分子探针的用量减少80%以上。大大降低了检测成本并提高了检测效率。可作为乳腺癌HER2基因检测的一项新技术;但在具体操作时,应注意严格控制切片厚度、消化时间及杂交后洗涤温度与时间等因素。

讨论：由于妇女乳腺癌的发病率居高不下，且有逐年增长的趋势，精确检测肿瘤细胞HER２基因状态对于患者的精准治疗和预后判断十分必要，因此美国病理医师协会建议所有乳腺癌患者均需检测HER２靶点，目前HER２蛋白靶点的检测主要通过免疫组化染色（IHC）来完成，HER２基因靶点的检测主要通过荧光原位杂交（FISH）来判定，前者成本低，但假阳性和假阴性高，适合于病患的初筛；而后者成本高，准确性也比较高，故成为HER２靶点检测的金标准，但病理样本的荧光染色不能长期保存。CISH技术具有敏感准确，重复性好，样本可长期保存，成本介于IHC和FISH法之间等诸多优点（3.4.5.6.7），未来有望替代IHC和FISH法成为HER２检测的首选，更由于采用原创性的高通量薄膜载片多孔板检测系统，每张病理样品的分子探针用量节省50%以上，在研究中我们注意到，由于我们使用的是显色双染CISH探针同时观察红色和绿色信号，绿色的HER2信号可能覆盖红色的着丝粒信号，或者出现相反的情况，都会导致HER2计数偏多或偏少的情况，导致HER2检测假阳性或假阴性的可能。扩增程度越高，HER2/CEN17的比值偏差越大。由于FISH是在油镜下观察（100倍），信号点会比CISH的40倍或60倍更大、更清晰和容易观察。并且，FISH可用不同滤片观察不同颜色，信号不易被遮挡，因此计数会更加准确，特别是不同颜色的信号重叠时。因此在临界比值样本中，CISH由于信号重叠，可能会有较大的比值偏差，需要用FISH进一步确认。临床实践表明对CISH计数的技术人员要求更高，已经熟悉FISH计数的技术人员还需进行进一步培训才能胜任CISH计数的工作，需要掌握明场视野下的组织学知识才能识别肿瘤细胞，完成CISH计数。这也是CISH相对FISH比值低的一个原因。操作过程中应严格控制切片厚度和酶的消化时间,一般要求切片厚度为4~5μm，酶的消化时间控制在5分钟; 切片越厚消化时间越长。杂交变性要彻底, 杂交后的洗涤温度和时间也很重要,最好控制在70~75℃;每次实验最好有阳性对照片,可以有效进行质量控制。

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