甘草细胞培养物黄酮含量测定方法的建立

作者：王磊 杨英 周圆圆 敖明章 余龙江

【摘要】 　　目的建立一种简单快速测定甘草细胞培养物中黄酮含量的方法。方法采用超声乙醇浸提法提取黄酮类物质，根据悬浮培养的甘草细胞中黄酮成分的结构和光谱特性，利用10％氢氧化钾为显色剂，在410 nm波长处测定样品中黄酮含量。结果吸光度值与黄酮含量呈良好线性关系（r=0.9994）；回收率为98.08%，RSD为1.6%（n=5）；测定结果在80 min内稳定。结论该方法操作简便、耗时少，可快速测定甘草培养物中黄酮含量。

【关键词】 甘草 悬浮培养 黄酮 分光光度法

　　Abstract：ObjectiveA spectrophotometry method for determination of flavonoids in the suspension cell of licorice was established.MethodsAccording to the characters of flavonoids in cell suspension culture of licorice, 10%KOH was chromogenic agent and absorbance was determined with spectrophotometry at 410 nm.Results The results showed that the linear range was between 0 and 0.05 mg/ml (r=0.9994) and the average recovery was 98.08% with corresponding RSD of 1.6% (n=5). ConclusionThis method is simple, convenient and suitable for determination of flavonoids in the suspension cell of licorice.

　　Key words：Licorice; Cell suspension culture; Flavonoids; Spectrophotometry

　　药用甘草为豆科甘草属多年生草本植物，以根和茎入药。临床及药理研究证明，甘草中主要药用成分之一的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化以及美白的作用［1～3］。由于掠夺性采挖，天然甘草资源已严重匮乏，而人工栽培周期长，占用土地资源。因此，一个很有前景的办法就是通过细胞大规模培养生产甘草黄酮及其它次生代谢物。目前，在甘草愈伤组织诱导与分化方面已有不少报道，而有关悬浮培养获得甘草黄酮的研究较少。其中有关黄酮类化合物的测定方法主要有高效液相色谱法［4］和比色法［5］。前者主要用于测定单一黄酮类成分；后者用于测定总黄酮。比色法大多采用亚硝酸钠－铝盐显色体系测定，此方法较繁琐耗时且不适用于缺少邻二酚羟基的黄酮类化合物的测定［6］。本实验根据甘草细胞培养物中黄酮化合物主要成分的结构特征和光谱特性，利用10%氢氧化钾为显色剂，芦丁为标准品，测定甘草细胞培养物中黄酮含量，该方法简单快速，为甘草细胞次生代谢调控和大规模培养研究过程中黄酮的检测提供了便可靠的方法。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 器材甘草悬浮细胞，由新疆胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.种子萌发的下胚轴诱导得到愈伤组织，建立其悬浮细胞系，本实验室保存。

UV-2100型紫外可见分光光度计（UNICO CORPORATION）， KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），离心机（SIGMA）。芦丁（SIGMA），氢氧化钾, 亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，乙醇等均为分析纯。

　　1.2 供试样品溶液的制备准确称取60 ℃干燥至恒重，研磨并过100目筛网的甘草悬浮培养细胞0.5 g，加75%乙醇15 m1，超声提取60 min。取出，放冷至室温，补足损失溶液。取提取液5 ml于5 000 r/min转速下离心5 min后，取上清液2.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

　　1.3 悬浮培养甘草细胞黄酮成分定性分析参照文献［7，8］进行显色反应，并按文献［5］利用亚硝酸钠－铝盐为显色剂对供试液显色并在400～500 nm波长进行扫描。

　　1.4 悬浮培养甘草细胞黄酮含量测定

　　1.4.1 检测波长的选择准确吸取标准品溶液、供试品溶液各1 ml，分别置10 ml容量瓶中。将两份溶液分别标记为1，2号，按标准曲线制备显色溶液，并在200～500 nm波长间进行扫描。

　　1.4.2 标准曲线的制备准确称取60 ℃干燥至恒重的芦丁对照品50.0 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。准确吸取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。准确量取标准品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分别置于10 ml试管中，再各加0.5 ml 10% KOH溶液，充分摇匀显色5 min后，用甲醇定容至10 ml，摇匀，用UV-2100分光光度计测定其在410 nm处的吸收值。以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。1.4.3 精密度、加样回收率及稳定性实验取同一批甘草细胞培养物分别制备5份样品溶液，按标准曲线方法显色，在410 nm处测定吸光度值，考察精密度；准确量取已知黄酮含量的1 ml提取液5份，分别加入一定量的芦丁标准品，按标准曲线制作方法显色，测定吸光度

计算黄酮含量，得出回收率；将已测样品于室温放置10，20，40，80 min后，测定样品吸光度，考察稳定性。

　　2 结果

　　2.1 悬浮培养甘草细胞黄酮成分定性分析通过黄酮类化合物特有的显色反应能够定性地判断其含有的成分。悬浮培养甘草细胞供试液进行的显色反应结果如表1 所示。结果表明，甘草细胞培养物含有结构中不包含邻二酚羟基的黄酮、黄酮醇、二氢黄酮等黄酮类化合物。对供试液和亚硝酸钠－铝盐反应体系进行波长扫描，反应体系在500 nm处没有出现相应的吸收锋，进一步说明了供试液中主要成分是不含邻二酚羟基的黄酮类化合物，结果见图3。以上实验表明，悬浮培养的甘草细胞主要成分是结构中不包含邻二酚羟基的黄酮、黄酮醇、二氢黄酮等黄酮类化合物。因此，亚硝酸钠-铝盐显色法不适用于悬浮培养甘草细胞中黄酮含量的测定。根据上述波长扫描图，反应体系存在410 nm左右的碱性显色体系吸收峰。表1 黄酮类化合物分析结果（略）

　　2.2 悬浮培养甘草细胞黄酮含量的测定

　　2.2.1 检测波长的选择通过对标准品溶液和样品供试液在200～500 nm波长范围内的扫描。表明芦丁标准品和样品溶液在410 nm具有相同的吸收峰及其最大吸收值，故选择410 nm为测定波长见图2。

　　2.2.2 标准曲线按方法1.4.2制得标准曲线，并计算得到标准方程A= 2.63C + 0.022 4，r=0.999 4（A为吸光度，C为标准品浓度）。实验表明标准品浓度在0～0.05 g/L范围内与吸光度A成良好的线性关系见图3。

　　2.2.3 精密度、加样回收率及稳定性实验精密度实验结果见表2，甘草细胞培养物中黄酮平均含量为6.415 mg/g，RSD=1.36<2%，精密度良好。加样回收实验结果如表3所示，平均回收率为98.08%，RSD为1.55%。将已测样品室温放置10，20，40，80 min后，测定样品吸光度，结果见表4。可见0～80 min内，样品的吸光度变化不大，RSD较小，稳定性良好。表2 精密度实验结果（略）

　　2.2.4 不同品种甘草悬浮细胞中黄酮含量的比较取摇瓶培养的不同种类的甘草细胞培养物，按方法1.2制备样品液，并按标准曲线方法显色，测定黄酮含量。结果表明不同品种甘草细胞悬浮培养物黄酮含量有一定差别。其中新疆胀果甘草细胞培养物黄酮含量较高为6.415 mg/g，其次是新疆乌拉尔甘草细胞培养物为5.124 mg/g，新疆光果光果细胞培养物较低为4.210 mg/g。表3 样品加样回收率实验结果（略）表4 稳定性实验结果（略）

　　3 讨论

　　通过对悬浮培养甘草细胞供试液的显色反应和光谱分析，表明甘草悬浮培养的细胞主要成分是黄酮、黄酮醇、二氢黄酮等结构中不含邻二酚羟基的黄酮类化合物，其具体成分结构还需进一步分析鉴定。

　　分别以75%乙醇和甲醇为溶剂溶解芦丁标准品，测定吸光度时，前者吸光度变化较大，后者稳定，这可能是由于芦丁在甲醇与乙醇中溶解性的不同引起的，故以甲醇为溶剂。

　　在前期的实验中比较了不同乙醇浓度做提取剂时对含量测定的影响，结果表明60%～75%乙醇浓度的提取剂提取效果较好。60%乙醇为提取剂显色时较易出现絮状沉淀，影响测定结果。这可能是由于提取液中含有部分细胞可溶性蛋白，当碱性显色时溶液pH值改变使得蛋白沉淀，而75%乙醇为提取剂则可避免，故本实验选择75%乙醇为提取剂。
本方法操作简单，耗时少，既克服了高效液相法复杂繁琐和标准品不易购买的问题，又弥补了亚硝酸钠-铝盐法不能准确测定黄酮化合物的不足，为甘草细胞次生代谢调控和大规模培养研究过程中黄酮的检测提供了简便可靠的方法。

　　对本实验室培养的新疆胀果、光果、乌拉尔甘草细胞培养物进行了黄酮含量的测定，结果表明，胀果甘草细胞培养物中黄酮的含量高于其它两种甘草品种，可作为悬浮培养及大规模培养获得甘草黄酮的优质材料。

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