简介：摘要目的构建表达甲型H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza A virus，H5N1 AIAV)NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒，为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)编码基因，并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tiantan，VTT)于Vero细胞中发生同源重组后，筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒(rVTT-HA/NA)，并对其进行鉴定。结果反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp，与预期相同。DNA测序证实，改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明，HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示，rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性，血凝滴度为1∶32。结论重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。

简介：摘要目的利用CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2，HSV-2)。方法利用CRISPR/Cas9技术对外源基因EGFP插入HSV-2基因组的策略进行探索，设计如下4种插入策略：(1)经典的同源重组修复模式，即环状双侧同源臂供体介导的基因敲入；(2)线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入；(3)同源性非依赖介导的基因敲入；(4)利用稳表达Cas9和sgRNA的细胞株，进行环状双侧同源臂供体介导的基因敲入。结果使用策略2、3和4均成功构建了携带EGFP的HSV-2，其中策略2的基因敲入效率最高，然后依次为策略3、策略4，策略1未观察到重组病毒的产生。蚀斑纯化后的重组病毒在7代内能稳定表达绿色荧光蛋白，并且和亲本株在Vero细胞上具有相似的生长特性。结论线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入效率更高，敲除载体的稳转细胞株能够有效地提高同源重组修复机制介导的基因敲入效率。

简介：

简介：无

简介：背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）相关因子1（XAF1）是新近鉴定的肿瘤抑制基因,在许多人类恶性肿瘤中低表达甚至不表达。目的：研究Ad5/F35腺病毒介导XAF1基因诱导人肝癌细胞株SMMC7721凋亡的作用及其可能机制。方法：构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1、对照病毒Ad5/F35-Null和报告病毒Ad5/F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别按不同感染复数（MOI）在同一作用时间点感染人肝癌细胞株SMMC7721。以荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad5/F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1mRNA和蛋白表达;以甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞增殖率;以AnnexinV-FITC/PI双染法和原位末端标记TUNEL法检测细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达。结果：Ad5/F35-EGFP感染48h,MOI为2.0时,92%以上的SMMC7721细胞表达绿色荧光蛋白。Ad5/F35-XAF1感染48h后,SMMC7721细胞中XAF1mRNA和蛋白表达增高,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡剂量依赖性地增多,并伴随凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的裂解。结论：重组腺病毒Ad5/F35-XAF1在人肝癌细胞株SMMC7721中具有很强的感染效率,可促进XAF1基因表达,且能明显抑制人肝癌细胞增殖和诱导凋亡,此作用可能与XAF1激活了内、外源性凋亡通路有关。

简介：摘要目的探讨敲低肿瘤坏死因子（TNF）-α对骨癌痛大鼠的镇痛作用和对脊髓和背根神经节（DRG）中瞬时受体电位香草酸受体1（TRPV1）的调节机制。方法构建稳定敲低TNF-α的病毒载体（AAV9-shRNA-TNF-α）后，40只SPF级健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（n=10），假手术组：大鼠左后肢胫骨骨腔中植入煮沸的Walker 256细胞构建假手术组；肿瘤细胞植入组（TCI组）：将Walker 256细胞植入大鼠左后肢胫骨骨腔中诱导骨癌痛模型；TCI+AAV9-shRNA-TNF-α组：TCI大鼠鞘内注射AAV9-shRNA-TNF-α；TCI+AAV9-shRNA-NC组：TCI大鼠鞘内注射AAV9-shRNA-TNF-α的阴性对照（NC）。各组大鼠造模前1 d及造模后1、3、7、14、21 d分别使用von Frey纤维测痛仪以及热板痛觉测试仪检测大鼠左后足的机械痛阈值和热痛觉缩足潜伏期；于造模后21 d处死各组大鼠取L4~L5节段脊髓和DRG。采用qRT-PCR和Western blot检测DRG和脊髓中TNF-α和TRPV1的表达。采用免疫荧光化学法检测脊髓TNF-α的水平。结果与假手术组比较，TCI组机械痛阈值在3 d（8.174±0.181）g、7 d（7.089±0.582）g、14 d（6.344±0.222）g、21 d（7.603±0.122）g降低（P值依次为0.006、0.021、0.016、0.022），热痛觉缩足潜伏期在3 d（6.41±1.05）s、7 d（6.21±0.15）s、14 d（6.58±0.12）s、21 d（6.42±0.47）s也降低（P值依次为0.003、0.018、0.012、0.032）；与假手术组比较，TCI组21 d时的DRG中TNF-α的mRNA和蛋白表达均升高（P=0.013与0.008），脊髓中TNF-α蛋白表达升高（P=0.017），DRG中TRPV1的mRNA升高（P=0.006），脊髓中TRPV1 mRNA和蛋白表达增加（P分别为0.016，0.009）。与TCI+AAV9-shRNA-NC组比较，TCI+AAV9-shRNA-TNF-α组机械痛阈值在3 d（12.224±0.802）g、7 d（15.331±1.917）g、14 d（18.903±5.882）g、21 d（21.321±4.695）g升高（P值依次为0.011、0.023、0.018、0.006），热痛觉缩足潜伏期在3 d（10.18±0.23）s、7 d（11.91±0.53）s、14 d（11.76±0.17）s、21 d（12.15±0.26）s也升高（P值依次为0.015、0.032、0.009、0.017）；与TCI+AAV9-shRNA-NC组比较，TCI+AAV9-shRNA-TNF-α组21 d的DRG中TNF-α的mRNA和蛋白表达均降低（P=0.029与0.017），脊髓中TNF-α蛋白表达降低（P=0.031），DRG中TRPV1的mRNA降低（P=0.036），脊髓中TRPV1 mRNA和蛋白表达降低（P=0.016，0.009）。结论沉默TNF-α可缓解骨癌痛模型大鼠的疼痛行为并抑制大鼠脊髓和DRG中TRPV1 mRNA水平及脊髓的TRPV1蛋白水平。

简介：摘要目的了解2015—2019年上海市普陀区急性呼吸道感染主要呼吸道病毒病原特征，并研究腺病毒的基因特征，为呼吸道病毒的防控特别是腺病毒的防控提供实验室依据。方法收集2015—2019年普陀区监测医院内急性呼吸道感染病例的咽拭子标本，使用多重PCR方法进行呼吸道病原体的检测，并对腺病毒阳性标本扩增Hexon基因测序分析。结果共检测775例标本，检出阳性525例，阳性率为64.74%。甲型流感病毒检出率最高，占66.48%（349/525）；其次为乙型流感病毒，占12%（63/525）；腺病毒占5.14%（27/525）；鼻病毒占3.81%（20/525）；肠道病毒占3.24%（17/525）；冠状病毒占3.05% （16/525）；副流感病毒占2.67%（14/525）；人偏肺病毒占2.48%（13/525）；人博卡病毒占0.38%（2/525），呼吸道合胞病毒未检出。27例腺病毒Hexon基因测序分析显示腺病毒3型17例，7型7例，4型2例，5型1例。结论上海市普陀地区急性呼吸道感染以流感病毒为主，腺病毒次之，腺病毒感染以3型和7型为主。

简介：摘要目的基于六邻体蛋白和纤维蛋白的联合基因测序和系统发育分析进行腺病毒性结膜炎中人类腺病毒(HAdV)分型。方法在上海地区收集2015年1月至2017年8月病毒性结膜炎患者下结膜囊结膜拭子样本256份，提取DNA后通过PCR扩增六邻体蛋白及纤维蛋白全长，完成基因测序及种系发生学分析。结果89例(占34.76%)患者结膜拭子六邻体蛋白基因扩增阳性，包括HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-B3、HAdV-E4、HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37各1、7、20、6、23、17和15例，分别占1.12%、7.87%、22.47%、6.74%、25.84%、19.10%和16.85%，其六邻体蛋白种系发生学分析中均与相应参考序列原型聚合。纤维蛋白种系发生学分析中，15例HAdV-D19样本序列和1例HAdV-D37样本序列交叉聚合。结论针对六邻体蛋白和纤维蛋白基因的联合测序可以为HAdV分型和毒力分析提供丰富有效的生物学信息。

简介：本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应.用AD5/F35-EGFP以不同MOI（感染复数）感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用.结果表明：对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞.在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用.结论：AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小.AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景.

简介：摘要目的研究2015-2019年上海地区急性呼吸道感染病例中腺病毒感染的流行病学特征和混合感染情况，为腺病毒的防控提供科学依据。方法收集2015-2019年上海地区3家医院内的急性呼吸道感染病例，对纳入病例进行相关信息登记和采样，进行呼吸道病原体的多重PCR检测。结果共纳入1 543例急性呼吸道感染病例，腺病毒阳性率2.92%（45/1 543），流感样病例（ILI）和严重急性呼吸道感染病例（SARI）中的阳性率分别为2.74%（29/1 058）和3.30%（16/485）。ILI在2019年1-5月的阳性率5.43%（7/129）高于2015-2018年同期的0.52%~4.48%（Fisher精确检验值=8.92，P=0.036）。45例腺病毒阳性病例的发病时间主要分布在第一、二季度，合计占62.22%（28/45），各季度发病阳性率的差异有统计学意义（χ2=12.52，P=0.006），以第二季度的阳性率最高（6.03%），高于其他季度的1.89%~2.93%。各年龄组间差异有统计学意义（χ2=16.94，P=0.001），且随着年龄的增加阳性率有降低的趋势（χ2=10.16，P=0.001），13~19岁组的阳性率（9.43%）高于其他年龄组（1.48%~4.81%）；学生组阳性率（12.07%）高于其他职业（2.61%），差异有统计学意义（χ2=11.53，P=0.001）。45例腺病毒阳性病例中混合感染占31.11%（14/45）。ILI和SARI的混合感染率分别为34.48%（10/29）和25.00%（4/16），14例混合感染病例中，腺病毒的主要混合感染病原是甲型流感病毒和冠状病毒。结论上海地区急性呼吸道感染病例中存在一定比例的阳性病例，需进一步加强青少年人群中的腺病毒监测，重点是关注第二季度的学生等重点人群。

简介：摘要目的探讨腺病毒结合蛋白3(BNIP-3)在肝细胞肝癌中的表达与缺氧及相关临床病理因素的关系。方法采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测烟台市烟台山医院2016年11月至2019年8月之间手术的65例肝癌组织、癌边缘组织、非癌组织中BNIP-3和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达，分析两者表达的相关性及与相关临床病理参数的关系。不同组织中mRNA表达的差异采用t检验，蛋白表达的差异采用Kruskal-Wallis H检验，BNIP-3和HIF-1α表达之间的相关性及与临床病理参数之间的比较采用Spearman相关性检验。结果肝癌组织与癌边缘组织BNIP-3、HIF-1α mRNA表达显著高于非癌组织，并且两者表达呈正相关(r＝0.638、0.532，P<0.05)，BNIP-3和HIF-1α在癌边缘组织蛋白表达阳性率分别73.8%、64.6%，显著高于癌组织及非癌组织(χ2＝38.587、31.128，P<0.05)。相关性分析发现肝癌组织中BNIP-3蛋白表达与淋巴结转移、癌栓、TNM分期及术后复发时间有关(r＝0.631、0.522、0.541、0.714，P<0.05)，与性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、肿瘤数目、病理分期等无关；肝细胞肝癌(HCC)患者术后无瘤生存时间随癌组织BNIP-3蛋白表达阳性强度增高而延长。结论BNIP-3在肝癌中的表达与缺氧及肝癌复发转移明显相关。

简介：无

简介：摘要目的总结体外膜肺氧合（ECMO）辅助治疗在重症腺病毒肺炎引起的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患儿中应用的临床护理经验。方法回顾性分析20例重症腺病毒肺炎合并ARDS患儿的临床资料，总结归纳其起病、治疗、并发症及预后等病程中的护理重点。结果20例患儿原发病均为重症腺病毒肺炎，ECMO治疗时长247.50（152.00，296.75） h。治疗后12例（12/20）成功脱离ECMO，存活出院11例（11/20），死亡9例（9/20）。ECMO治疗过程中17例（17/20）患儿出现并发症。出院后随访半年至2年，9例生命质量、社会功能良好，精神运动发育正常；2例因缺血、缺氧脑功能损害，于医院或家庭持续康复锻炼中。结论儿童重症腺病毒肺炎合并ARDS病情危重，当其他治疗手段无效后，ECMO治疗可为可逆性心肺衰竭患儿提供心肺支持治疗，但并发症多且严重，预防和减少相关并发症是ECMO辅助成功的关键。

简介：摘要目的利用汉逊酵母系统重组表达人细小病毒B19(human parvovirus B19, B19V)主要衣壳蛋白VP2，并对VP2病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)进行理化性质研究及免疫效果评价。方法重组表达B19V VP2蛋白，并使其自组装成VLP；通过高密度发酵和系列层析纯化步骤获得VP2-VLP；SDS-PAGE和凝胶过滤高效液相色谱检测蛋白质纯度，动态光散射和透射电镜观察颗粒形态，并检测VP2-VLP磷脂酶活性。采用ELISA和红细胞凝集抑制试验检测小鼠体内VP2-VLP特异性IgG抗体和中和抗体水平。结果本研究制备的重组VP2-VLP纯度大于95%，颗粒均一且形态良好，大小近似天然病毒颗粒；VLP可与特异性单克隆抗体结合，磷脂酶A2活性为阴性；吸附佐剂后的VP2-VLP能够诱导小鼠产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体。结论汉逊酵母表达系统制备的B19V VP2-VLP可作为候选靶抗原用于B19V预防性疫苗的开发。

简介：摘要目的研究HCV重组体J6/JFH1在Huh7细胞中复制并产生感染性病毒颗粒。方法将HCVRNA转染至Huh7细胞中，待转染效率达80%左右，收集上清液，感染新的Huh7细胞，得到的病毒命名为一代病毒，取一代病毒感染效率达80%左右的上清液，感染新的Huh7细胞，得到的病毒命名为二代病毒，测定转染与2次感染收集病毒的滴度。结果在将HCV病毒转染和感染Huh7细胞后，HCV阳性细胞达80%的时间分别是第13天、第5天及第5天，三次最高滴度分别是3.9FFU/ml,4.5FFU/ml及4.6FFU/ml。结论成功在Huh7细胞内培育出带有适应性突变的J6/JFH1病毒，为HCV体外培育提供了新思路，为耐IFN的丙肝治疗奠定了基础。

简介：比较双链腺相关病毒（Double－strandedadeno－associatedvirus，dsAAV）及单链AAV（Single－strandedadeno－associatedvirus，ssAAV）介导Exendin－4分泌表达效率。应用基因工程方法构建dsAAV／pSSHG／Exendin－4，与重组ssAAV比较转染NIH3T3细胞效率及转染后细胞上清Exendin－4浓度，免疫组化检测Exendin－4表达。经限制性内切酶及测序证实载体构建成功，测定重组dsAAVpSSHG／Exendin－4滴度为2．5＆#215;1011pfu，较重组ssAA滴度高（2．5×109pfu）；dsAAV／pSSHG／GFP转染NIH3T3细胞表达绿色荧光强；ELISA法检测感染重组dsAAV的NIH3T3细胞上清中Exendin－4的浓度为181．1±8．75pmol／ml，较重组ssAAV分泌浓度（133．81±8．09pmol／ml）升高（P＜0．05）；重组dsAAV及ssAAV转染NIH3T3细胞Exendin－4表达均为阳性。重组dsAAV可分泌表达Exendin－4并较ssAAV具有更高效转染能力，为研究Exendin－4功能及应用于临床打下基础。

简介：摘要目的原核表达古尔图病毒(Guertu virus, GTV)糖蛋白截短片段(Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2)，分别纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白并制备其多克隆抗体。方法采用RT-PCR的方法分别扩增得到GTV DXM毒株截短糖蛋白Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2基因片段，并将其构建到原核表达载体pET-32a(＋)中，继而转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，SDS-PAGE分析蛋白质大小。经镍柱亲和层析纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白，用GTV阳性羊血清通过Western blot法检测重组蛋白的抗原性。用纯化的蛋白质分别免疫新西兰白兔制备抗血清，ELISA法检测血清效价。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2转染至哺乳动物Vero细胞，并用间接免疫荧光法评估前述制备的兔多克隆抗体的结合活性。最后用Western blot法检测血清与重组蛋白的特异性反应能力。结果双酶切鉴定和测序结果表明pET-32a-Gn、pET-32a-Gn1/Gn2/Gn3、pET-32a-Gc1/Gc2、pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2重组表达载体构建正确，重组表达蛋白Gn-His、Gn1/Gn2/Gn3-His、Gc1/Gc2-His相对分子质量(Mr)大小分别约为63.4×103、37.1×103、31.9×103、30.8×103、40×103和54.4×103。重组表达蛋白能够被GTV阳性羊血清所识别；获得的抗GTV Gn、Gc1和Gc2兔多克隆抗体效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶6 400。间接免疫荧光检测和Western blot结果表明制备的多克隆抗体能够与真核表达产物或重组蛋白发生特异性反应。结论重组GTV糖蛋白Gn-His、Gc1-His和Gc2-His得到了高效表达和纯化，具有较好的免疫性。制备的多克隆抗体效价高，特异性好。本研究结果为进一步开展GTV糖蛋白生物学功能及其检测方法和疫苗研究提供参考资料。

简介：摘要：目的  探讨保妇康栓联合重组人干扰素治疗HPV病毒的临床效果。方法  选取2020年2月-2022年2月本院收治的80例HPV感染患者为对象。随机分为观察组（保妇康栓联合重组人干扰素）与对照组（重组人干扰素），比较两组治疗效果。结果  观察组总有效率为95.00%，高于对照组（80.00%，P

简介：摘要目的利用不同型别呼吸道腺病毒核酸标准品对呼吸道病原体核酸检测试剂进行最低检测限性能评价。方法选择已研制的1、2、3、4、5、7、55型呼吸道腺病毒核酸标准品，参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)的EP17-A2文件，采用Probit回归方法对28种不同方法学原理的呼吸道病原体核酸检测试剂的最低检测限(Lod)进行评估，比较各试剂盒声称Lod和评估Lod之间以及对不同腺病毒型别检测Lod之间的差异。结果28种试剂盒中能够准确评估Lod的比例为50%(12/24)。12种试剂盒的评估Lod与声称Lod一致性较好；12种试剂盒一致性较差，其中4种试剂盒差异较小(measured Lod<5×claimed Lod)，8种试剂盒差异较大(measured Lod>5×claimed Lod)，最大者可达24 000倍。不同试剂间评估的Lod浓度差异可达106数量级以上(最低和最高分别为20拷贝/ml和4.8×107拷贝/ml)；同种试剂对不同型别腺病毒的检测Lod均不相同，其浓度差异最高可达104数量级(最低和最高分别为5.0×103拷贝/ml和4.8×107拷贝/ml)。结论部分呼吸道病原体核酸检测试剂检测腺病毒的最低检测限性能评估缺乏准确性，使用检测范围内的多种病原体型别或亚型进行性能评估尤为必要。

简介：程序性细胞死亡因子5（programmedcelldeath5,PDCD5）在多种肿瘤细胞中表达明显降低。携带pdcd5基因的靶向增殖型腺病毒SG611-pdcd5对白血病细胞具有杀伤作用,对正常细胞具有相对保护作用。本研究旨在观察联合应用SG611-pdcd5与低剂量化疗药物依托泊甙（etoposide,VP-16）对白血病细胞系K562的作用。以不同浓度梯度的药物或不同感染复数（multiplicityofinfection,MOI）的病毒液作用于K562细胞,培养48小时后用MTT法检测细胞存活率。结果表明,与SG611-pdcd5（MOI=40）或VP-16（0.5μg/ml）单独作用组相比,SG611-pdcd5（MOI=40）＋VP-16（0.5μg/ml）组细胞存活率明显降低（p均〈0.05）,分别为（59.45±4.12）%、（82.91±3.41）%及（42.00±5.75）%。SG611-pdcd5与VP-16的协同作用强于PDCD5蛋白或携带pdcd5基因的非增殖型腺病毒Ad-pdcd5与VP-16的协同作用（p均〈0.05）;VP-16浓度为4.0μg/ml时,VP-16＋SG611-pdcd5（MOI=40）组、VP-16＋proPDCD5（40μg/ml）组及VP-16＋Ad-pdcd5（MOI=80）组细胞存活率分别为（37.09±1.89）%、（52.36±1.64）%及（73.64±4.33）%。结论：SG611-pdcd5具有促进低剂量VP-16杀伤K562细胞的作用,二者联合可增强对白血病细胞的杀伤作用。