简介:摘要目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3),在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo,shRNA慢病毒重组质粒构建成功后,将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞,从而获得病毒液。实验Ⅰ 采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组(n=6):空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组,各组分别转染MOI为10的相应病毒液,转染48 h时,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率,以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ 采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组(n=36):空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组,各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体),于转染24、48和72 h时,采用CCK-8法测定细胞存活率,荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率。结果实验Ⅰ 成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×108 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较,shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调(P<0.01),shRNA-A2aR 3慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ 选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时,各组细胞存活率均>85%;转染48 h时,MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%;转染72 h各组细胞存活率<70%。倒置荧光显微镜下可见,MOI5组荧光密度稍低,MOI10组转染48 h及MOI20组转染24 h时,荧光密度较高且细胞状态较好;转染72 h时各组心肌细胞活力明显下降、死亡细胞增加。Western blot显示:MOI10组转染48 h、MOI15组转染48 h、MOI20组转染24和48 h时干扰效率均>70%。结论成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体,且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。
简介:摘要目的探讨血清铁蛋白(Fer)在中老年男性2型糖尿病(T2DM)合并肌少症患者中的变化及意义。方法于2018年4月至2019年5月对苏州大学附属第一医院内分泌科住院治疗的中老年男性T2DM患者进行体成分分析,按2014年发布的亚洲肌少症共识,根据身高校正的四肢骨骼肌指数(ASMI)及握力诊断肌少症。选取T2DM肌少症组82例,T2DM非肌少症组92例。测定两组血清铁蛋白水平,比较两组一般资料、身体测量及临床指标的差异。采用Spearman相关分析血清铁蛋白与其余临床指标的相关性,以二元logistic回归分析中老年男性T2DM患者合并肌少症的影响因素。结果T2DM肌少症组血清铁蛋白水平高于T2DM非肌少症组,分别为243.10(205.75,367.51)、176.68(137.31,218.16)ng/ml,差异有统计学意义(P<0.01)。血清铁蛋白与腰臀比(r=0.284)、体脂百分比(r=0.266)、内脏脂肪面积(r=0.159)、hsC-RP(r=0.242)、HbA1c(r=0.319)、TC(r=0.155)、LDL-C(r=0.161)、FT4(r=0.178)均呈正相关(P均<0.05),与T2DM病程(r=-0.261)、全身骨骼肌质量(r=-0.410)、四肢骨骼肌质量(r=-0.352)、ASMI(r=-0.423)、TSH(r=-0.273)均呈负相关(P均<0.05)。在中老年男性T2DM患者中,高体重指数、高全身骨骼肌质量是肌少症发病的独立保护因素(优势比分别为0.144、0.267,P<0.05),而高血清铁蛋白、高内脏脂肪面积是其独立危险因素(优势比分别为1.015、1.136,P<0.05)。结论铁蓄积与T2DM患者的肌少症密切相关,高血清铁蛋白是中老年男性T2DM患者合并肌少症的独立危险因素。
简介:摘要目的探讨长期预防性应用丁苯酞对永久性大脑中动脉远端闭塞小鼠的神经保护作用及其与核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)通路的关系。方法将Nrf2+/+野生型和Nrf2-/-基因敲除小鼠随机分为对照组(等体积植物油)、小剂量丁苯酞组(20 mg/kg)和大剂量丁苯酞组(60 mg/kg),每组各6只。通过灌胃方式每日给药1次,持续1个月,然后通过电凝法建立永久性大脑中动脉远端闭塞模型,模型制作后继续给药,直至第10天处死。在模型制作后第3天和第10天时应用改良Longa分级量表和转棒实验评价神经功能缺损情况。在处死后通过三苯基氯化四氮唑染色检测脑梗死体积,通过干湿重法检测脑含水量,通过定量实时聚合酶链反应以及蛋白质印迹法测定缺血区脑组织Nrf2通路相关因子表达,包括Nrf2、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶1(NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1)。结果造模后第10天时,与Nrf2-/-对照组相比,Nrf2+/+对照组神经功能缺损显著较轻,脑梗死体积和脑含水量均显著较小,而且Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及蛋白水平显著较高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。对于Nrf2+/+小鼠,与对照组相比,大剂量丁苯酞组脑梗死体积显著缩小(P<0.05),脑含水量显著降低(P<0.05),神经功能恢复显著更好(P<0.05),而且Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及蛋白水平显著较高(P均<0.05)。对于Nrf2-/-小鼠,各组间神经功能、脑梗死组体积、脑含水量、Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及蛋白水平均无显著统计学差异。结论长期丁苯酞预处理能显著改善永久性大脑中动脉远端闭塞小鼠小鼠神经功能,缩小脑梗死体积,降低脑含水量,并且提高Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及蛋白表达水平,提示丁苯酞可能通过上调Nrf2基因及其下游抗氧化应激因子HO-1和NQO1表达发挥神经保护作用。