简介:细胞毒T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)是激活的T细胞表达的一种膜蛋白,属免疫球蛋白超家族成员,它通过与B7分子的结合来阻止共刺激信号的传递,抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖活化,起到抑制免疫反应及诱导免疫耐受的作用。CTLA-4在自身免疫病、过敏性疾病、感染、肿瘤及抗移植排斥等领域具有广阔的应用前景。简要综述了CTLA-4的基因、分子结构,及其与T细胞应答的关系。
简介:BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.
简介:目的:构建4E—BPl及其T37A、T46A、$65A、T70A突变体4E—BPl-4A基因表达的重组慢病毒载体,研究其对胃癌HGC27细胞生长的影响。方法:PCR扩增4E—BPl基因及其突变体aE—BPl-4A基因并克隆到pCDH载体,构建成pCDH-4E—BPl、pCDit一4E—BPl—4A,将其-9包装载体共转染293T细胞,包装成Lenti-4E—BPl及Lenti-4E—BPl—4A重组慢病毒载体,将此慢病毒感染胃癌HGC27细胞,Western印迹鉴定病毒载体介导的4E—BPl、4E~BPl—4A蛋白的表达,MTT、克隆形成和软琼脂方法研究过量表达4E—BPl、4E—BPl—4A对胃癌HGC27细胞生长的影响。结果:包装成Lenti-4E—BPl及Lenti-4E—BPl—4A重组慢病毒载体,并将此慢病毒载体感染胃癌HGC27细胞;MTT、克隆形成、软琼脂实验表明过量表达4E—BP!可抑制胃癌HGC27细胞的生长,过量表达4E—BP!一4A时抑制效果更明显。结论:构建了4E—BPl、4E—BPI-4A的重组慢病毒表达载体,在胃癌HGC27细胞中过量表达4E—BPl可抑制细胞生长,过量表达4E—BPl-4A的抑制效果更明显。
简介:目的:构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体,并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因,检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果:参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得M和CD40L基因片段,将其与pCI—neo载体相连,测序证实该载体构建成功后,将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO—K1中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论:构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达,为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。
简介:CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2区、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤筛选转染的CHO-dhfr-细胞。用RT-PCR、ELISA、细胞免疫荧光染色和Western-blot鉴定重组蛋白的表达。采用A蛋白纯化重组蛋白。
简介:目的:建立一种高效的末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)方法,检测工程土壤细菌。方法:以深圳和香港两地不同土层(0.5,10,20和30m)的工程土壤为研究对象,提取并纯化总DNA,利用细菌16SrDNA基因通用引物8f-FAM/1492r进行PCR扩增,扩增产物分别用HhaⅠ、HaeⅢ和MspⅠ限制性内切酶酶切,酶切产物经毛细管电泳测序,序列上传至数据库进行分析。结果:经过比对分析,香港段土壤中大约存在细菌141属,235种;深圳段大约存在132属,206种;32个细菌种属只在香港土壤中有分布,3个细菌种属只在深圳土壤中有分布;植物病原细菌有14个种属。结论:建立的T-RFLP方法能够高效、快速地分析工程土壤细菌。
简介:P16ink4是CDK抑制蛋白,参与调控细胞G1期至S期的转换。目前发现P16`(ink4)基因损伤与多种肿瘤的发生、发展有关,可能是功能上非常重要的抑癌基因。为了研究该基因的功能,以及突变对该基因功能的影响,本文应用RT-PCR方法,从Hela细胞中克隆了P16ink4cDNA。扩增得到556bp片段(包括引物两端酶切位点的16bp)克隆于M13载体,测定了其DNA序列。该序列包括了P16ink4cDNA编码区全部471bp,以及3’端69bp序列。表明P16ink4cDNA已成功地得到克隆。
简介:目的:合成新型蛋白转导域PTD4,研究其细胞内穿膜效应及在体组织分布。方法:设计并采用固相合成法合成新型蛋白转导域PTD4,用FAM(羧基荧光素)进行标记,采用高效液相色谱仪(HPLC)和质谱仪测定其纯度与相对分子质量;采用荧光倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察其在细胞内的穿膜情况;采用裸鼠活体成像观察穿膜肽在体内的组织分布及代谢特性,并切片观察各组织器官的分布情况。结果:合成了新型蛋白转导域PTD4,纯度为95.76%,相对分子质量为1776.5;PTD4在体外的穿膜效应有时间与浓度依赖性,约24h代谢完毕,且共聚焦显微镜细胞层扫证实穿膜肽进入胞内;尾静脉注射的PTD4在裸鼠体内可迅速分布于各组织器官,但组织分布不均一,且有时间与浓度依赖性,6h后荧光强度下降了大半,且腹腔注射方法不如尾静脉注射的穿膜效率高。结论:采用Fmoc固相肽合成法可成功合成蛋白转导域PTD4;PTD4能高效穿透细胞膜,穿膜效应呈时间与浓度依赖性;PTD4在体内能迅速分布于各组织细胞。