简介：目的获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子（PIP,包含5＇调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5kb）构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-HindIIIEGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化：将HindIII酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3＇端的内含子剪接受体位点（splicingacceptorsite,SA）突变为HindIII内切酶识别位点,命名为PIP-SA（M）-EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Westernblot检测,验证载体的表达效率。结果转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光。RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异：载体PIP-HindIII-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA（M）-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Westernblot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3＇端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。

简介：目的探究富含n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid,PUFA）的苏子油高脂饮食对肥胖大鼠肝脏极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoproteins,VLDL）合成关键基因表达的影响.方法造模期：雄性SD大鼠随机分为2组,对照组（normalcontrolgroup,NC）给予普通日粮,高脂组（highfatgroup,HF）给予高脂纯合日粮诱发肥胖大鼠模型;干预期：将肥胖大鼠随机分为4组：持续高脂组（consistenthighfatgroup,CHF）和三个苏子油（perillaoil,PO）替代组,根据PO替代CHF中猪油比例的不同将替代组分为20%PO、50%PO、100%PO,4周后测定大鼠血清甘油三酯（tryglyceride,TG）水平;westernblotting方法检测肝脏VLDL合成关键蛋白微粒体甘油三脂转运蛋白（microsomaltriglyceridetransferprotein,MTP）和载脂蛋白B（apolipoproteinB,APOB）蛋白表达;real-timePCR方法检测肝脏Mtp、ApobmRNA表达.结果肥胖大鼠血清TG水平显著高于NC组,并且有严重的脂肪沉积,肝脏MTP和APOB的mRNA、蛋白表达均有不同程度的降低;干预4周后,与CHF组相比,各PO替代组大鼠血清TG水平明显降低,病理切片结果显示肝脏脂肪沉积有明显改善,并且肝脏MTP和APOB的mRNA、蛋白表达均有不同程度的升高.结论不同比例PO替代均能促进肥胖大鼠肝脏VLDL合成与分泌,改善肝脏脂肪沉积,并且PO促进MtpmRNA、蛋白表达具有剂量依赖性.

简介：目的构建人胰岛素基因真核高效表达载体,为胰岛素转基因研究奠定基础.方法用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α-GFP,回收1.2kbEF1α启动子,插入到pCMV-mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中,获得重组质粒pEF1α-mINS;将pCMV-mINS和pEF1α-mINS分别转染BHK细胞,用G418筛选,阳性克隆传至20代后,分别用放免方法和免疫组化法分析胰岛素和/或胰岛素原在BHK细胞中的表达情况.结果经放免测定,pCMV-mINS和pEF1α-mINS在BHK细胞中胰岛素和/或胰岛素原的表达量分别为4.077μIU/ml和6.897μIU/ml.经免疫组化分析,pCMV-mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为190.0±19.56;pEF1α-mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为181.4±18.45,在BHK细胞核中表达水平的灰度值为155.4±11.66.结论在BHK细胞中启动子EF1α启动胰岛素基因表达的活性比启动子CMV高.