简介：摘要目的研究HAD和非HAD的艾滋病患者不同部位来源的Tat蛋白氨基酸位点变异及其对U87细胞氧化应激的影响。方法采用BLAST和MEGA6对一例HAD患者(H)和一例非HAD患者(N)的基底节(BG)、脾脏(SPL)共4个部位来源的HIV-1 Tat蛋白进行序列分析，研究其氨基酸位点变异，并将tat基因转染至U87细胞，显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)初步判断Tat蛋白表达情况，Western blot检测细胞Tat蛋白的表达；并使用cck-8法、Western blot、MDA检测试剂盒研究不同部位Tat蛋白对细胞活性、氧化应激指标GPX、MDA水平的影响。结果氨基酸序列分析显示N-BG、N-SPL、H-BG、H-SPL来源的HIV-1 Tat蛋白关键氨基酸位点存在差异；Tat蛋白可抑制U87细胞的活性，抑制作用可以被抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)逆转。与对照组相比，四个实验组MDA水平均升高，GPX蛋白表达量均降低，差异具有统计学意义(P＝0.012，P＝0.004，P＝0.000，P＝0.003；P＝0.000，P＝0.016，P＝0.000，P＝0.021)；且不同部位的Tat蛋白诱导细胞氧化应激的能力不同，H-BG组MDA水平高于N-BG部位，差异具有统计学意义(P＝0.023)；且无论是HAD还是非HAD患者BG组GPX含量均低于SPL组，差异有统计学意义(P＝0.01，P＝0.007，P＝0.01，P＝0.007)。结论HAD及非HAD患者外周及中枢神经系统中的Tat蛋白关键氨基酸位点存在差异，对细胞氧化应激的影响也不同。

简介：摘要目的探讨HIV-1负调控因子(Nef)在HIV-1神经致病性中的作用。方法从HIV-1相关痴呆(HIV-associated dementia, HAD)患者的中枢神经系统(central nervous system, CNS)和外周5个部位(基底结、额叶皮质、脑膜、颞叶皮质和脾)中获得5株不同的HIV-1 nef基因，与载体pcDNA3.1连接构建重组的pcDNA3.1-nef真核表达载体，转染人神经胶质瘤细胞U87。转染后22 h、27 h、32 h、37 h和42 h经免疫组化法和Western blot检测Nef蛋白表达情况，采用JEDA801D和JD-801软件对结果进行半定量分析。转染后27 h～62 h，每间隔5 h收集U87细胞的培养上清，ELISA测定上清中两种细胞因子TNF-α和IL-1β的含量，分析两种细胞因子的动态表达情况。结果成功构建5株来自一例HAD患者不同部位组织的nef基因的重组的pcDNA3.1-nef真核表达载体，转染U87细胞。免疫组化实验的结果显示，Nef蛋白在转染后42 h开始表达，Western blot进一步证实了这一结果。ELISA结果显示，转染后22 h、27 h、32 h、37 h，各组上清中细胞因子的含量随时间逐渐增多，但各组间的差异均无统计学意义(TNF-α：F＝0.445, P＝0.837; F＝0.579, P＝0.742; F＝0.617, P＝0.714; F＝2.728, P＝0.057。IL-1β：F＝2.656, P＝0.062; F＝0.485, P＝0.809; F＝0.165, P＝0.982; F＝2.463, P＝0.093); 42 h后，各组细胞因子含量逐渐降低，57 h～62 h，TNF-α及IL-1β含量基本维持稳定；转染后42 h、47 h、52 h、57 h、62 h，实验组两种细胞因子的含量明显高于对照组，差异有统计学意义(TNF-α：F＝241.310, P<0.001; F＝242.638, P<0.001; F＝250.114, P<0.001; F＝143.877, P<0.001; F＝146.172, P<0.001。IL-1β：F＝251.578, P<0.001; F＝188.816, P<0.001; F＝276.240, P<0.001; F＝238.136, P<0.001; F＝163.361, P<0.001)，各对照组间或实验组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论HIV-1 Nef蛋白能诱导并增强U87细胞分泌TNF-α和IL-1β的能力，而HAD患者体内不同来源的HIV-1 Nef蛋白发生氨基酸变异对U87细胞分泌TNF-α和IL-1β无影响。