简介：摘要目的构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（F值分别为8.168、4.644、1.981，均P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均P > 0.05）。结论成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

简介：摘要目的探讨乳腺癌改良根治术后内乳电子线大分割照射剂量学特征及急性不良反应、近期疗效。方法选择2018—2020年收治155例乳腺癌改良根治术后患者，Ⅲ期137例(88.4%)，Ⅱ期18例(11.6%)。所有患者均接受规范的化疗、内分泌治疗和抗Her2靶向治疗。按第1、2、3肋间将内乳临床靶体积(CTVim)分为3个亚区(CTVim1、CTVim2、CTVim3)，同时勾画锁骨上下区形成计划靶体积(PTVsc)。胸壁CTV和CTVim采用6~15 MeV电子线照射43.5 Gy分15次，3周完成。PTVsc采用6 MV X线二维放疗或三维放疗43.5 Gy分15次，3周完成。评估内乳、PTVsc及肺、心脏、左前降支(LAD)和右冠脉(RA)的剂量学特征，分析急性不良反应、近期疗效。结果CTVim的Dmean为(43.3±2.6) Gy，D95%为(30.5±8.3) Gy，V90%为(85.0±10.5)%，V80%为(91.0±7.4)%。CTVim1的相应参数值显著低于CTVim2和CTVim3(均P<0.001)。体质指数对内乳剂量无影响(P>0.05)。三维放疗比二维放疗技术显著增加CTVim的Dmean[(43.4±2.6) Gy∶(41.4±2.3) Gy，P＝0.021]和PTVsc的热点体积[V110%：(26.7±17.5) cm3∶(12.5±8.4) cm3，P＝0.018；V120%：(6.1±5.3) cm3∶(2.0±2.6) cm3，P＝0.023]。患肺Dmean为(9.8±1.9) Gy，V20Gy为(19.7±4.7)%。全组患者心脏Dmean为(3.3±1.7) Gy，左乳腺癌为(4.7±1.4) Gy，右乳腺癌为(2.6±1.2) Gy。左乳腺癌患者LADDmean为(13.9±4.9) Gy，右乳腺癌患者RADmean为(7.5±3.7) Gy。≥2级急性放射性皮炎、放射性食管炎、放射性肺炎发生率分别为19.3%、4.5%、2.6%。中位随访20.5个月(9.9~41.8个月)，2例胸壁复发，2例区域淋巴结复发，6例远处转移，死亡1例。结论乳腺癌改良根治术后内乳电子线大分割照射时肺、心、冠脉剂量较低，患者急性不良反应轻且发生率低。但第1肋间的内乳剂量偏低，虽然近期随访疗效较好但需要长期随访。