超声波法优化毛冬青叶中总黄酮的提取

于兆阳

摘 要：筛选干燥的毛冬青叶为原料，方法：采取正交试验研究不同的乙醇体积分数、超声温度、超声波提取时间、超声波提取功率对总黄酮提取率的影响，并利用单因素实验对三种因素进行分析，探究各因素对黄酮提取率的影响。分析利用紫外分光光度法（UV）测定毛冬青叶总黄酮含量，结果：当乙醇体积分数为75%，超声温度30℃，超声波提取时间30min，超声波提取功率40W，该条件下毛冬青叶中总黄酮的提取率达1.33%。

Abstract: Dried Holly leaf was selected as raw material. Methods: Orthogonal test was carried out to study the effects of different ethanol volume fraction, ultrasonic temperature, ultrasonic extraction time and ultrasonic extraction power on the extraction rate of total flavonoids, and the three factors were analyzed by single factor experiment to explore the effects of each factor on the extraction rate of flavonoids. The content of total flavonoids was determined by ultraviolet spectrophotometry (UV). The results showed that under the conditions of 75% ethanol, 30℃ ultrasonic temperature, 30min ultrasonic extraction time and 40W ultrasonic extraction power, the extraction rate of total flavonoids reached 1.33%.

关键词：毛冬青叶 正交试验 单因素实验 总黄酮提取率

毛冬青【1】属冬青科中冬青属植物，其根、叶、茎已被证实均可入药。别名又为茶叶冬青、细叶冬青等，毛冬青主要分布于我国南部广东、江西和湖南等省，中医理论古书记载，毛冬青叶具有活血通脉，消肿止痛，清热解毒等作用。毛冬青叶所包含的化学成分更为复杂【2】,主要含有黄酮苷类、酚类、木质素、三萜类、糖类等化学成分。因此对毛冬青叶中化学成分的提取分离及工艺优化具有较高的应用价值。

1 材料与方法

1.1仪器与设备

毛冬青叶：安徽亳州；芦丁标准品；亚硝酸钠（杭州龙山化工有限公司）；硝酸铝（天津市北辰方正试剂有限公司）；氢氧化钠（十堰鑫思特环保科技有限公司）；乙醇（鑫泽化工）；

AK-100SD 900W超声波清洗器；UV-250紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；万分之一分析天平（上海析牛仪器有限公司）。

1.2毛冬青叶前处理

将称量好的毛冬青叶完全粉碎，并采用国标5号筛筛选，将所得毛冬青叶粉末放入密封袋中储存待用。

1.3毛冬青叶中总黄酮的提取方法

精密称取5g毛冬青叶粉末，放入装有已知乙醇体积分数的锥形瓶内，瓶口采用PVC膜进行密封，放入参数设置好的超声波清洗器内进行提取。

1.4毛冬青叶中总黄酮的测定

参考文献【3】的方法配置芦丁标准曲线，采用硝酸铝-亚硝酸钠显色方法进行显色，利用紫外分光光度计于508nm下测定所提取出毛冬青叶的总黄酮吸光度。

2实验结果

2.1芦丁标准曲线的绘制

精密称取2.5mg干燥且恒重的芦丁标准样品，用少许质量分数为50%的乙醇搅拌溶解，后将其吸取并移入至25ml的容量瓶内并加入质量分数为50%的乙醇定容至刻度线，备用，得到浓度为0.1mg/ml的芦丁标准样品。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml的芦丁标准液依次放入干燥且恒重的25ml的容量瓶内，加入质量分数为5%的亚硝酸钠1ml，再加入质量分数为10%的硝酸铝1ml，最后加入质量分数为4%的氢氧化钠10ml，后用50%的乙醇溶液定容至刻度线。所得标准曲线方程为y=6.344x-0.0054，R2=0.9988，相关度拟合性较好，因此该标准曲线方程可用。

通过使用可见分光光度计，我们在440nm~580nm的范围内对已配置好的芦丁标准液进行扫描测量，结果显示，在508nm处，芦丁标准液的吸收值最高，这是实验所需的波长。在509nm波长范围内，通过测量不同浓度的芦丁标准液的吸光度值，绘制出芦丁标准曲线，如图一所示。

1.2总黄酮提取率的计算公式

【4】

毛冬青叶总黄酮提取率%=

符号说明：A为毛冬青提取液中总黄酮的吸光度；为移液枪吸取定容的总黄酮体积，ml；为所用的乙醇溶液提取的体积

2.2毛冬青叶总黄酮提取工艺优化

2.2.1正交实验设计优化及结果

表1正交实验因素水平表

水平	因素
	乙醇体积分数（%）	超声温度（℃）	超声时间（min）
1	70	30	25
2	75	35	30
3	80	40	35

表2正交实验结果表

编号	因素				提取率（%）
	乙醇体积分数（%）	超声温度（℃）	超声时间（min）
1	1	1	1	1.25
2	1	2	2	1.23
3	1	3	3	1.15
4	2	1	2	1.14
5	2	2	3	1.31
6	2	3	1	1.34
7	3	1	3	1.22
8	3	2	1	1.24
9	3	3	2	1.23
均值1	1.21	1.2	1.21
均值2	1.26	1.26	1.2
均值3	1.23	1.24	1.22
极差	0.05	0.06	0.02
因素主次	超声温度＞乙醇体积分数＞超声时间
优化方案	乙醇体积分数2＋超声温度2＋超声时间2

1.3单因素实验对毛冬青叶黄酮提取率的影响考察

1.3.1乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

精密称取5份干燥的毛冬青粉末5g，采用超声温度35℃，超声时间30min，加入不同梯度的乙醇质量分数，即为70%、75%、80%，将所得的溶液抽滤并按照配置芦丁标准液的方法定容到相应的体积，按照亚硝酸钠—硝酸铝显色法进行显色，使用可见分光光度计测定不同质量分数下提取的毛冬青根总黄酮的吸光度值（A），便得到毛冬青根总黄酮提取率受质量分数的影响关系如下：

1.3.2超声温度对黄酮提取率的影响

称取及测量方法同1.3.1，将超声温度设置为25℃、30℃、35℃。便得到毛冬青根总黄酮提取率受超声时间的影响关系如下：温度过低黄酮无法析出，温度过高黄酮挥发。

1.3.3超声时间对黄酮提取率的影响

称取及测量方法同1.3.1，采用不同的超声时间20min、25min、30min。便得到毛冬青根总黄酮提取率受超声时间的影响关系如下：时间过低导致黄酮无法溶出，时间过高导致黄酮挥发。

3结果与展望

本课题目的在已有的研究上对毛冬青叶【6】中黄酮类含量提取工艺进行优化。毛冬青中含有的黄酮还具有一定的抗氧化性，又为后续研究提供理论依据，充分利用毛冬青有限资源有重要意义。最后确定的最佳工艺为乙醇体积分数75%，超声温度35℃，超声时间30min。

[1]唐婷范,邓起东,李晓慧等.毛冬青叶中总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究[J].食品研究与开发,2018,39(21):77-82.

[2]冯华芬. 毛冬青叶化学成分研究[D].广西师范大学,2012.

[3]陈卫琳,程再兴,陈红等.正交设计优选毛冬青总黄酮提取工艺[J].辽宁中医药大学学报,2011,13(10):62-63.

[4]旷春桃,王清华.毛冬青根中总黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学,2009,37(01):180-181.

[5]彭红英,区文英,陈阅珠等.毛冬青根、茎枝入药研究[J].中成药,1998(08):39-40+51.