斑马鱼降尿酸治疗痛风的功效测试研究

高广涛

摘要：本文的目的是为了对斑马鱼降尿酸治疗痛风进行功效测试，以此对降尿酸效果进行医学探索。因此，对本实验进行材料与方法的选取，并在选取的基础上对实验的原理进行学习，依据实验原理对样本进行分组，并且，进行尿酸功假设检验。在进行上述操作之后，实验结果发现样品对斑马鱼尿酸抑制率为39%，样品能显著抑制斑马鱼尿素的形成，具有降尿酸效果。

关键词：斑马鱼降尿酸 痛风 功效测试

引言：

随着现代生活节奏加快、现代生活方式逐渐多样化，人类的疾病发生率呈现年轻化和频繁化。其中，存在的普遍现象就是，人们因为体内尿酸过多而产生痛风疾病疾病。而急性痛风往往呈现出关节疼痛急性发作等典型症状。疾病总是在轻微受伤、饮食过度等情况之后，尤其喜欢在肢体远端处进行疾病发作，比较典型的就是足痛风疾病，此外，也会因为尿酸盐产生肾绞痛。慢性的痛风一般呈现的特征为对关节的破坏。因此，一旦对痛风疾病控制不到位，也会引发很多严重的并发症，例如肾衰竭、高甘油三酯血症以及糖尿病等。因此，有必要对痛风疾病进行病学理研究，探索尿酸在痛风病当中起到的作用，积极进行尿酸实验，以达到对通风疾病的防治[1]。

人体内产物产生过多的尿酸来不及进行排泄或者人体尿酸机制发生退化，其最终结果会导致人体尿酸滞留。根据权威资料进行参考，在人体血液的尿酸浓度大于7mg/dl后，会导致人体体液变酸，如果对此情况进行长期搁置，最终会导致人体发生痛风。斑马鱼目前已经成为检验人体尿酸的疾病模型参照物，将氧嗪酸钾和别嘌呤醇进行联合处置第5天的斑马鱼，以便建立起斑马鱼机型高尿酸模型，可以用来对降尿酸效果进行测试和评估。因此，可见斑马鱼降尿酸实验对于人类进行痛风治疗医学事业具有重要的医学实验价值。

1材料与方法

1.1受试样品信息

表1 斑马鱼降尿酸功效测试受试样品信息表

样品编号	202304102B002	样品类别	药食同源
样品名称	酸秒清茶	样品状态	粉末
生产单位	安徽华耀堂药业有限公司	数量	1包
生产批号/日期	/	储存条件
建议使用方法	口服用：一日2次，每次用量8克。

根据上表显示，样品编号为202304102B002，样品类别为药食同源，样本名称为酸秒清茶，测试样品状态为粉末状，生产单位为安徽华耀堂药业有限公司，数量为1包，建议使用方法为口服，一日2次，每次用量8克。

1.2设备

斑马鱼养殖设备、产卵盒/缸、水质监测设备、分析天平、显微镜、玻璃或聚苯乙烯测试容器（如6孔板、培养皿)、恒温箱、丰年虾孵化器、移液管、玻璃容器（如烧杯、容量瓶等)、离心管、旋涡混合仪、超声水浴锅、离心机、低温冰箱、可调节移液器和吸头。

1.3试剂与耗材

表2 试剂耗材内容表

试剂耗材名称	试剂耗材内容
水	符合GB/T 6682
助溶剂：	甲醇、二甲基亚砜、乙醇等
亲鱼养殖用水	称取4g海盐溶于10L水配制而成
丰年虾 （Artemia salina）卵	丰年虾休眠卵需干燥避光冷藏
鱼胚胎培养液	1mM 别嘌呤醇溶液
尿酸诱导溶液	10mM 氧嗪酸钾和5mM 黄嘌呤钠盐溶液
别嘌呤醇溶液	1mM 别嘌呤醇溶液
PBS	/
尿酸试剂盒	Solarbio尿酸试剂盒

根据上述可知，试剂与耗材中，水符合GB/T 6682规定；甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶剂为分析纯级别；亲鱼养殖用水，称取4g海盐溶于10L水配制而成，盐度为0.25%-0.50%，电导率为500μS/cm-800μS/cm，溶解氧为≥80%的饱和度，pH值为6.5-8.5范围之间，硬度30mg/L-300mg/L（以碳酸钙计）；丰年虾（Artemiasalina）卵，称取约15g海盐溶于1L水配制丰年虾卵孵化水，密度以不超过4g/L丰年虾卵为宜；鱼胚胎培养液，称取2940mg无水氯化钙，1233mg七水硫酸镁，630mg碳酸氢钠，55mg氯化钾溶于10L水配制而成，pH值6.5-8.5，化学品均为分析纯级别；尿酸诱导溶液，用鱼胚胎培养液配制10mM氧嗪酸钾和5mM黄嘌呤钠盐溶液，使用前新鲜配制；别嘌呤醇溶液，用鱼胚胎培养液配制1mM别嘌呤醇溶液，使用前新鲜配制。

1.4实验方法

实验方法为受试生物、养殖要求、产卵要求三种，分别涉及受试、养殖、产卵三个步骤。下面对上述三种方法进行详细阐述。

其一，受试生物。应用来源可靠（如中国国家斑马鱼资源中心)的野生型AB品系斑马鱼（Danio rerio）产卵测试。亲鱼应具有较好的繁殖能力-鱼龄以6～12月最佳。传代尽量使用侧交以保持遗传多样性，纯品系亲鱼繁殖5代后需更换新一批亲鱼。亲鱼不应该有明显可见的感染和疾病特征，且在2个月内没有经历过药物治疗。在繁殖产卵测试前，亲鱼应在引入实验室后驯养14天以上。

其二，养殖水温宜控制在26℃~28.5℃，室内温度建议控制在20℃~25℃；养殖密度宜控制在每升水1～2尾鱼，以及每日固定的12h～16h光照，且需保持良好的过滤系统；每天至少喂食2次，包括至少1次丰年虾（Artemia salina）幼虫，喂食间隔在3小时以上，避免过量喂食影响水质和清洁度；

其三，如用产卵缸收集鱼卵，将雄鱼和雌鱼以2:1的比率为宜在产卵前一天关灯前1h～2h放进产卵缸中，由于斑马鱼偶尔不产卵，建议同时准备多个产卵缸备用；为避免基因偏差，将最少3个产卵缸中收集的鱼卵混合再进行挑选备用，若用养殖鱼缸收集鱼卵，收卵盒在产卵前一天关灯前或产卵当天开灯前放进要收集鱼卵的养殖鱼缸中；为避免鱼卵被成鱼所食，收卵盒用惰性网覆盖；交配、产卵和受精在开灯后大约30min内完成，届时可把收卵盒移出鱼缸鱼卵从收卵盒取出后，建议用鱼胚胎培养液清洁鱼胚胎；挑选健康的斑马鱼胚胎，并以200μL鱼胚胎培养液中不超过1尾鱼胚胎的密度于28℃±1℃培养至受精后3天。

2检验原理

如果体内产生过多来不及排泄或者尿酸排泄机制退化，则体内尿酸滞留过多，当血液尿酸浓度大于7mg/dl，导致人体体液变酸，长期置之不理将会引发痛风。斑马鱼已经广泛用作人类疾病模型，通过氧嗪酸钾和别嘌呤醇联合处理孵化第5天的斑马鱼建立斑马鱼急性高尿酸模型，可以用于测试和评估样品是否具有降尿酸效果。

3检验过程

3.1受试物准备

受试物包含化学品、食品、药物、原料及产品。配制受试物测试溶液时，首选溶剂是水，如需用到有机溶剂助溶，可选用甲醇或二甲基亚砜，溶剂于测试溶液中的浓度不要超过0.1%。

3.2测试步骤

图1 斑马鱼尿酸抑制测试流程图

由上述图可知，斑马鱼尿酸抑制测试流程为，首先从斑马鱼母体产卵开始，对斑马鱼的卵体进行收集，利用实验仪器显微镜对卵体进行甄别，挑选出正常生命的斑马鱼卵体，在经过3天的精心培育后，斑马鱼卵体发育成大斑马鱼卵，将大斑马鱼卵放置在实验器皿之中，将准备好的受试物与大斑马鱼卵进行分组实验，将培育在实验器皿之中的实验样本在经过两天后的培养后，进行蛋白质的提取，然后利用测试蛋白质的仪器进行抑制率计算和分组假设检验对照。

3.3测试分组

测试需设定空白对照组（斑马鱼胚胎培养液)、模型对照组（尿酸诱导溶液)、阳性对照组（尿酸诱导溶液+别嘌呤醇溶液)和受试物组（尿酸诱导溶液+受试物)；

空白对照组设置：随机挑选30尾斑马鱼至24孔板中，每孔30尾斑马鱼2mL斑马鱼胚胎培养液；模型对照组设置：随机挑选50尾斑马鱼至24孔板中，每孔30尾斑马鱼2mL尿酸诱导溶液；阳性对照组设置：随机挑选50尾斑马鱼至24孔板中，每孔30尾斑马鱼2mL含尿酸诱导溶和别嘌呤醇溶液；受试物处理：随机挑选50尾斑马鱼至24孔板中，每孔10尾斑马鱼2mL含尿酸诱导溶液和受试物的鱼胚胎培养液。

3.4分组处理

将孔板放置于28℃±1℃恒温箱中培养1天。然后对各组进行下列处理。空白对照组：替换为新的2mL斑马鱼胚胎培养液。模型对照组：替换为2mL尿酸诱导溶液。阳性对照组：替换为2mL含尿酸诱导溶液和别嘌呤醇溶液。受试物处理组：替换为2mL含尿酸诱导溶液和受试物的鱼胚胎培养液。放置于28℃±1℃恒温箱中培养1天。

3.5测试尿酸含量

将每测试孔的斑马鱼分别收集到试管中，冰中麻醉，用PBS浸洗一次。然后加入100μLPBS进行冰浴匀浆，于4℃以10，000rpm离心10min，取上清液进行尿酸含量测试。将25μL上清液和25μL尿酸检测试剂盒中的反应液及50μL的Amplexfi红试剂/HRP/uricase工作液加入到微孔板中，鱼37℃反应30min，然后于酶标仪中测试505nm处的吸光率。对每管中的上清液进行3次测试取平均值[2]。

尿酸含量计算：

按样本质量计算：

UA含量（μg/尾）=x×V取×M/N=84x/N

V提取：提取液体积，0.5ml；

M:尿酸分子质量，168；

N:用于研磨的斑马鱼尾数。

4检验结果

4.1数据和结果计算

计算尿酸抑制率：

（1)式中：

S—受试物处理组斑马鱼尿酸水平的平均值；

M—模型对照组斑马鱼尿酸水平的平均值；

B—空白对照组斑马鱼尿酸水平的平均值；

计算各试验组的平均值及标准误，统计学处理结果用平均值±标准误表示。使用统计学软件对数据进行方差分析，对受试物组和模型对照组间斑马鱼尿酸水平进行双尾T检验，取得p值。p<0.05表示有显著性差异。这表明尿酸抑制率的结果具有统计学价值[3]。

5假设检验

5.1测试有效性验证

测试判定：各测试组暴露完成后至少90%斑马鱼存活，否则对应测试组结果无效。

测试要求：每批次测试须设置阳性对照组，阳性对照组斑马鱼尿酸抑制率为正数且p<0.05。

5.2结果报告

尿酸抑制率：受试物在对应测试浓度下对斑马鱼尿酸的抑制率。

5.3评价

评价受试物抑尿酸水平的能力，受试物处理组与模型对照组的检测值进行分型，看是否具有统计学差异（p<0.05)。

5.4测试结果

表3斑马鱼尿酸抑制率测试表

样品名称	酸秒清茶
样品编号	VI-20231361S-2
测试	测试浓度	结果	降尿酸功效评价
斑马鱼尿酸抑制率	1.15g/L*	39% （p=0.0029)	显著

*以70kg体重每日8g摄入量计算，测试浓度为10倍日摄取量。

样品在1.15g/L测试浓度下对斑马鱼尿酸抑制率为39%（p=0.0029)。在尿酸抑制率为正数且具有统计学差异（p<0.05）情况下，测试结果可作为受试物具有降尿酸功效的支持证据。样品能显著抑制斑马鱼尿素的形成，具有降尿酸效果[4]。

5.5分组测试结果

图2降尿酸功效测试结果图

根据分析结果显示，空白对照组较于模型对照组，其抑菌率下降100%，样品处理组相对于模型对照组，其抑菌率上升153%。因此，结果显示，空白对照组、模型对照组和样品处理组的分组实验得到了应具有的合理设计效果[5]。

6讨论

为了探究斑马鱼降尿酸治疗痛风的功效，前期进行了受试样本和各种器材的准备，采取的实验方法为受试生物、养殖要求和产卵要求。其中，受试生物方法主要是对化学物品、食品、药物、原料以及产品等进行选择，并在此基础上对受试物溶液进行配置，在这个过程中进行溶剂的使用，比如甲醇、二甲基亚砜，特别注意使用的测试溶液浓度再0.1%以内。养殖方法的展开过程主要注重温度、密度、过滤系统等，在对养殖的温度、密度、喂食等方面进行把握之后，尤其要对水质和清洁度进行良好的控制，并在此基础上达到对养殖环境的改善，进一步实现对养殖要求的完美实现。产卵方法主要是使用产卵缸收集鱼卵，将雌雄比例控制在2：1左右中，交配、产卵和受精在开灯30分钟以内完成[6]。

此外，需要对实验的测试步骤进行梳理。斑马鱼尿酸抑制测试流程为，首先从斑马鱼母体产卵开始，对斑马鱼的卵体进行收集，利用实验仪器显微镜对卵体进行甄别，挑选出正常生命的斑马鱼卵体，在经过3天的精心培育后，斑马鱼卵体发育成大斑马鱼卵，将大斑马鱼卵放置在实验器皿之中，将准备好的受试物与大斑马鱼卵进行分组实验，将培育在实验器皿之中的实验样本在经过两天后的培养后，进行蛋白质的提取，然后利用测试蛋白质的仪器进行抑制率计算和分组假设检验对照。但是，需要特别指出的是，在对实验样本进行分组的时候，测试假定样本分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组和受试物对照组，其中空白对照组是斑马鱼胚胎培养液培养出来的，模型对照组是尿酸诱导溶液培养出来的，阳性对照组是尿酸诱导溶液和别嘌呤醇溶液综合培养出来的，受试物组是尿酸诱导溶液和受试物培养出来的，在孔板放置于28℃±1℃恒温箱中培养1天后，对上述四个组进行分别处理[7]。

最后，在进行分组处理以后，就进行实验的实际检验，首先就是对尿酸含量的检测。即取样上清液，对尿酸含量进行测试。把255μL上清液和25μL尿酸检测试剂盒中的反应液及50μL的Amplexfi红试剂/HRP/uricase工作液加入到微孔板中，鱼37℃反应30min，然后于酶标仪中测试505nm处的吸光率。对每管中的上清液进行3次测试取平均值。利用样本质量计算公式，对尿酸含量进行抑制率计算，在进行各实验组的平均值与标准误差的计算之后，进行统计学软件的方差分析，对受试物组和模型对照组进行斑马鱼尿酸水平的双尾检验，结果显示P值小于0.05，表示结果显著。接着，进行分组相关性检验，在尿酸抑制率为正数且具有统计学差异（p<0.05）情况下，测试结果可作为受试物具有降尿酸功效的支持证据。也就是说，在测试浓度为1.15g/L的条件下，结果显示为39%，P值为0.0029，降尿酸功效显著。

综上所述，斑马鱼降尿酸功效测试结果为，样品在1.15g/L测试浓度下对斑马鱼尿酸抑制率为39%（p=0.0029)，样品能显著抑制斑马鱼尿素的形成，具有降尿酸效果。

参考文献：

[1] OECD. Test No.236:Fish Embryo Acute Toxicity （FET）Test[S], OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing,Paris,2003

[2] T/GDST 1-2021斑马鱼胚胎急性毒性测试A 法和B 法[S]。

[3] DB32/T3979-2021实验用斑马鱼饲育技术条件[S]。

[4] ISO 15088-2017 污水对斑马鱼胚胎的急性毒性测试[S]。

[5] ZhangY,LiQ,Wang F,Xing C.A zebrafish （danio rerio）model for high-throughpul    screening food and drugs with uric acid-lowering activity[J].Biochemistry and Biophysiolog）Research Communication,2019,508:494-498

[6] MarchettiM,LiuzziA,FermiB,CorsiniR.Folli C.SperanziniV.GandolfF,Bettati S. Ronda L,Cendron L,Berni R,Zanotti G,Percudani R.Catalysis and structure of zebrafishurate oxidase provide insights into the origin of hyperuricemia in hominoids[J]. Scientific Reports 2016.6:10. 1038/srep38302

[7]XiongXY,LiangJ,GuoSY,DaiMZ.ZhouJL,ZhangY,Liu Y.A natural compley product Yaocha reduces uric acid level in a live zebrafish model[J]. Journal of Pharmacologica Toxicology Methods, 2020,102:10668