黄芪微生物限度检查方法适用性试验

李适培

摘  要

目的：建立黄芪微生物限度检查方法。方法：依据中华人民共和国药典2020版四部中的中药饮片微生物限度检查法，进行方法适用性试验。结果：微生物计数方法适用性试验：将黄芪按 1：10稀释后，采用平皿法中的倾注法进行微生物回收试验;控制菌检查方法适用性试验： 将黄芪进行1：10稀释后，取规定的检测培养基，依照相应的控制菌（大肠埃希菌，沙门菌）检查方法进行试验 。结论：经过方法适用性试验，本品可采用该方法进行微生物检查 。

［关键词］： 黄芪；微生物限度检查； 方法适用性； 控制菌检查；

1  绪论

中药饮片微生物限度检查法正式录入中国药典2020版四部 ，系正式出版药典里新增内容。检查内容有两个：计数菌检查主要测试检品中5种菌的含量是否在合格的范围内，控制菌检查按照指示特性，检测检品中是否含有指示菌以及可能菌数。黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge. var.  mongholicus ( Bge. ) Hsiao  或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch. )Bge. 的干燥根。产中国东北、华北及西北。生于林缘、灌丛或疏林下，亦见于山坡草地或草甸中，中国各地多有栽培，为常用中药材之一。黄芪性味:甘，微温。黄芪则以补虚为主，常用于体衰日久、言语低弱、脉细无力者。现代医学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。能消除实验性肾炎蛋白尿，增强心肌收缩力，调节血糖含量。黄芪不仅能扩张冠状动脉，改善心肌供血，提高免疫功能，而且能够延缓细胞衰老的进程。临床上常见的高血压、糖尿病、缺血性心脏病等均可选用黄芪作为药材选方。根据研究表明，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素，不含抑菌成分不会对微生物限度检查存在较大影响，通过对黄芪进行微生物限度适用性试验，进一步为中药饮片的质量检查提供检查方法参考。

2  仪器与样品

2.1  仪器

超低温冰箱 ThermoScientific 991，电子天平 MP500B（1/100，上海恒平科学仪器有限公司），高压灭菌器 GR88DX（厦门致微仪器有限公司），热空气消毒箱 GR-246（上海博迅实业有限公司），SW-CJ系列洁净工作台 SW-CJ-2FD （苏州安泰空气技术有限公司），生化培养箱HPX-II-250（上海跃进医疗器械有限公司），霉菌培养箱 HMJ-Ⅲ-250(上海跃进医疗器械有限公司),电热恒温培养箱 DPX-9162B-1(上海福玛实验设备有限公司)，全封闭智能匀浆仪ZW-800D（温州维科生物实验设备有限公司）

2.2  菌种

菌种均购自温州微穹微生物技术有限公司，均属于定量菌株，直接复溶使用

金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］ 批号： GC201116-1第三代

铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］ 批号： GC200713-1 第三代

枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］ 批号： GC200711-2A第三代

白色念珠菌［CMCC（F）98001］ 批号： GC201019-1第三代

黑曲霉菌［CMCC（F）98003］ 批号： GC200711-3A第三代

大肠埃希菌［CMCC（B）44102］ 批号： GC201104-1第三代

乙型副伤寒沙门菌［CMCC（B）50094］ 批号： GC200707-1第三代

2.3  实验用培养基

胰酪大豆胨液体培养基（210617），胰酪大豆胨琼脂培养基（200909），沙氏葡萄糖琼脂培养基（191112），肠道菌增菌液体培养基（191231）， 木糖懒氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（200904），RV沙门菌增菌液体培养基（200116），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（211125），

麦康凯液体培养基（200602），麦康凯琼脂培养基（200815），均来自北京陆桥技术股份有限公司。使用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂。

2.4  样品

黄芪，来自广东蓬春制药有限公司，批号分别为210701，210702，210703。

3  试验方法

3.1  菌液的制备

用1.1ml复溶液复溶冻干定量菌株，内含纯活性微生物100-999cfu，即每0.1ml含10-99cfu的菌悬液。

3.2  供试液的制备

取本品25g，加入胰酪大豆胨液体培养基225ml，用匀浆仪充分混匀，取其液体为1：10供试液。取1：10供试液经水浴（98～100℃）30分钟处理后迅速冷却，作为耐热菌总数测定用供试液。然后用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。

3.3  微生物计数方法适用性试验

3.3.1 验证目的

确认本实验室按《中国药典》2020版四部通则1108中药饮片微生物限度检查方法和条件进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、耐热菌总数检查能保证检验结果的准确、可靠。由于样品包装完好无污染，样品本身也无含有抑菌成份，因此本次试验耐热菌总数、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数用1:10的供试液，进行方法适应性试验。

3.3.2  需氧菌总数

（1）试验组：取1:10供试液9ml，加入试验菌液1ml，充分混匀，使每1m供试液中含菌量不大于100cfu，取1ml注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，混匀，待凝固后，倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按菌落计数方法测定试验组的平均菌落数。

（2）供试品对照组：取1:10供试液9ml，以稀释液代替菌悬液同试验组操作，按菌落计数方法测定供试品对照组的平均菌落数。

（3）菌液组：取胰酪大豆胨液体各9ml，分别加入各种试验菌1ml，充分混匀，使每1m供试液中含菌量不大于100cfu，取1ml注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，混匀，待凝固后，倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按菌落计数方法测定菌液组的平均菌落数。

（4）回收比值：

各菌株回收比值=（试验组的平均菌落数—供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数。结果见表1

3.3.3 耐热菌总数

取1：10供试液经水浴（98～100℃）30分钟处理后迅速冷却，作为耐热菌总数的供试液，同3.3.2（1）、（2）、（3）、（4）步操作。结果见表2

3.3.4 霉菌和酵母菌总数

（1）试验组：取1:10供试液9ml，加入试验菌液1ml，充分混匀，使每1m供试液中含菌量不大于100cfu，取1ml注入平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml，混匀，待凝固后，倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按菌落计数方法测定试验组的平均菌落数。

（2）供试品对照组：取1:10供试液9ml，以稀释液代替菌悬液同试验组操作，按菌落计数方法测定供试品对照组的平均菌落数。

（3）菌液组：取胰酪大豆胨液体各9ml，分别加入各种试验菌1ml，充分混匀，使每1m供试液中含菌量不大于100cfu，取1ml注入平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，混匀，待凝固后，倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按菌落计数方法测定菌液组的平均菌落数。

（4）回收比值：

各菌株回收比值=（试验组的平均菌落数—供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数。结果见表3

3.4 控制菌检查方法适用性试验

按《中国药典》2020版四部通则1108中药饮片微生物限度检查方法控制菌应检查耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌。

3.4.1耐胆盐革兰阴性菌检查

阳性对照：取1:10供试液，25℃预培养2小时，作为预培养物，各取预培养物1ml接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，各加入每1ml含菌数不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液和铜绿假单胞菌菌悬液1ml，按耐胆盐革兰阴性菌的检查法试验。

供试液：取1：10的供试液20~25℃预培养2小时，以稀释液配制成1:100、1：1000供试液，各取1ml供试液分别加至10ml肠道增菌液体培养基中，30~35℃培养24小时。结果见表4

3.4.2大肠埃希菌检查

阳性对照：取1:10供试液10ml和每1ml含菌数不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，按大肠埃希菌的检查法试验。

供试液：  取1:10的供试液10ml，加至100ml胰酪大豆胨液体中，混匀， 30~35℃培养24小时。结果见表5

3.4.3沙门菌检查

阳性对照：取本品10g，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，用匀浆仪充分混匀，加入每1ml含菌数不大于100cfu的沙门菌菌悬液1ml，按沙门菌的检查法试验。

供试液：取本品10g，加至100ml胰酪大豆胨液体中，用匀浆仪充分混匀，30~35℃培养24小时。结果见表6

4  试验结果

4.1  微生物计数方法适用性试验结果

依据中国药典2020版四部准则1108，所有试验菌的回收值平皿倾注法中都在0.5～2标准范围内。

             表1  1:10需氧菌总数方法适用性试验结果

培养基	菌种	菌落计数（cfu/mL）					回收值
		试验组		菌液对照组		供试品对照组
胰酪胨大豆琼脂培养基 （TSA）	金黄色葡萄球菌	33	35	30	28	8	0.9
		33	35	29	29	8	0.9
		33	35	29	29	8	0.9
	铜绿假单胞菌	34	34	23	23	8	1.1
		34	34	23	23	8	1.1
		34	34	23	23	8	1.1
	枯草芽孢杆菌	32	32	30	31	8	0.8
		32	32	31	31	8	0.8
		32	32	31	30	8	0.8
	白念珠球菌	39	40	37	37	2	1.0
		40	40	37	37	2	1.0
		40	40	37	37	2	1.0
	黑曲霉菌	25	25	17	17	2	1.4
		25	25	17	16	2	1.4
		25	25	17	17	2	1.4

由表1可得知，证明1：10供试液的试验结果符合中国药典2020版四部的标准范围内，即采用“3.3,2”项微生物计数方法可进行符合规定。

表2  1:10耐热菌总数方法适用性试验结果

培养基	菌种	菌落计数（cfu/mL）					回收值
		试验组		菌液对照组		供试品对照组
胰酪胨大豆琼脂培养基 （TSA）	金黄色葡萄球菌	30	30	32	32	0	0.9
		30	30	32	32	0	0.9
		30	30	32	32	0	0.9
	铜绿假单胞菌	23	23	25	25	0	0.9
		23	23	25	25	0	0.9
		23	23	25	25	0	0.9
	枯草芽孢杆菌	32	32	30	30	0	1.1
		32	32	30	30	0	1.1
		32	32	30	30	0	1.1
	白念珠球菌	43	43	40	40	0	1.1
		43	43	40	40	0	1.1
		43	43	40	40	0	1.1
	黑曲霉菌	25	25	25	25	0	1.0
		25	25	25	25	0	1.0
		25	25	25	25	0	1.0

由表2可得知，证明1：10供试液的试验结果符合中国药典2020版四部的标准范围内，即采用“3.3,3”项微生物计数方法可进行符合规定。

表3  1:10霉菌和酵母菌总数方法适用性试验结果

培养基	菌种	菌落计数（cfu/mL）					回收值
		试验组		菌液对照组		供试品对照组
沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）	白念珠球菌	39	40	35	33	2	1.1
		40	40	35	35	2	1.1
		40	40	34	35	2	1.1
	黑曲霉菌	24	25	20	20	2	1.2
		24	25	20	20	2	1.2
		25	25	20	20	2	1.2

由表3可得知，证明1：10供试液的试验结果符合中国药典2020版四部的标准范围内，即采用“3.3,4”项微生物计数方法可进行符合规定。

4.2  控制菌检查方法适用性试验结果

4.2.1耐胆盐革兰阴性菌

有表4的指示结果可知，试验组和阳性对照组的指示结果为有菌落生长，而供试品对照组阴性对照组指示结果无菌落生长。所以“3.4.1”的试验方法能够检查出这种控制菌。

表6耐胆盐革兰阴性菌微生物检查方法适用性试验结果

培养基	试验组	供试品对照组	阳性对照组（大肠菌）	阳性对照组（铜绿假单胞）	阴性对照组
肠道菌增菌液体培养基	+	-	+	+	-
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基	+	-	+	+	-

注：“+”表示有这种控制菌生长，“-”则表示无。

4.2.2大肠埃希菌

有表5的指示结果可知，试验组和阳性对照组的指示结果为有大肠埃希菌生长，而供试品对照组阴性对照组指示结果无。所以“3.4.2”的试验方法能够检查出这种控制菌。

表5大肠埃希菌微生物检查方法适用性试验结果

培养基	试验组	供试品对照组	阳性对照组	阴性对照组
麦康凯液体培养基	+	-	+	-
麦康凯琼脂培养基	+	-	+	-

注：“+”表示有这种控制菌生长，“-”则表示无。

4.2.3  沙门菌

有表6的指示结果可知，试验组和阳性对照组的指示结果为有沙门菌生长，而供试品对照组阴性对照组指示结果无沙门菌生长。所以“3.4.3”的试验方法能够检查出这种控制菌。

表6 沙门菌微生物检查方法适用性试验结果

培养基	试验组	供试品对照组	阳性对照组	阴性对照组
RV沙门菌增菌液体培养基（RV）	+	-	+	-
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）	+	-	+	-

注：“+”表示有这种控制菌生长，“-”则表示无。

5  结论与分析

中药饮片微生物限度检查法已经被新增入中华人民共和国药典2020版四部通则，对中药材以及中药饮片质量控制体系进一步完善，为我国建立具有严谨科学性的中药材及中药饮片质量标准，为保障我国中药饮片的安全、有效和质量可控提供了技术以及方法上的保证。

为了避免空气中或仪器可能存在杂菌影响试验，所使用的培养基、玻璃器皿、以及相关用具均为进过灭菌处理；严格遵循洁净室守则，在试验前开洁净室紫外灯0.5h后关闭并开通风机；从传递试验物品进入洁净室前，均要用消毒水擦拭表面；在操作过程中，用专门相对应的移液器吸取菌液，避免交叉污染；试验操作除培养外均在洁净室进行。整个试验环境控制的较为良好。综上所述，说明本次实验并未受到环境以及器材的影响，大大减小了实验可能存在的误差。

本试验发现采用通则里常规方法中1:10稀释度进行需氧菌总数、耐热菌总数、霉菌和酵母菌总数的回收试验时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠球菌和黑曲霉菌的回收比值均在0.5～2药典标准范围内，因此最终确认用1：10稀释度进行黄芪的计数菌检查；接下来进行控制菌检查方法适用性试验时，初步用1:10稀释度进行试验时，即可得到符合中国药典规定的指示结果，最终亦确认以1:10稀释度即可进行黄芪控制菌检查。综上所述，在试验开始先应用常规方法中的最低稀释度检查时，这操作可能使得供试品的有效抑菌成分浓度较高而导致供试品中原有的某些菌株生长被明显抑制时，无论计数菌检查还是控制菌检查，都可以先进行最低稀释度进行方法适用性试验观察记录其结果，然后再根据其结果，逐步提高供试品的稀释程度进行相应试验，以确保试验的科学性、严谨性、可靠性。本次试验先前了解并根据黄芪的药理性质进行试验预估，客观试验结果并未脱离理想结果。

中药饮片及中药材系按照中医药理论可供临床中药直接使用的独特药物类型，其来源主要为植物药、动物药、矿物药，由于入药部位、炮制工艺和药物的特性不同等等因素，不仅其中有效成分差别具有明显差别，而且其中微生物负载情况也具有很大差别，照搬常规检查方法必定导致检验结果产生偏差。现如今中国药典2020版四部通则增加了中药饮片微生物限度检查法，为保证药品微生物检查的正确性，除了试验基础设施和环境，以及专业检验人员的硬性要求外，还需因中药饮片的抑菌活性的差别，依据前人的经验结果，根据某些中药饮片的特性对检验方法进行适用性方法试验。

4  参考文献

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[5]张光华,王似锦,江志杰,高春.北京地区销售的10种中药饮片微生物污染程度考察[J].中国药房,2018,29(14):1940-1944.

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