多重实时荧光定量PCR方法在高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测中的应用

赖锦锋

摘要：目的：在研究中基于多重实时荧光定量PCR的方法以及相关的技术，来建立一个能够同时对14中高危型人乳头瘤病毒进行检测与分析，来有效地建立一个对癌基因E6/E7mRNA的检测方法。方法：在此次研究中选取我院223例临床样本进行检测与分析，来探究14种高危型人乳头瘤病毒中，不同病毒的E6/E7基因序列，来探究这些基因序列中存在的区域设计特异性，并且结合相对应的反应体系来构建一个高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA的检测方法与系统。在实验中需要结合这些临床样本来利用温核算扩增技术进行高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测，最终来探究其检测结果与宫颈组织病理学检测结果之间是否存在着一致性。结果：在实验中所建立的检测方法，能够在试验检测中将检测限提升更高的程度，并且对于一些常见低危型HPV中也并没有出现交叉检出的情况，使用多重实时荧光定量PCR方法所检测出的结果与Aptima HPV检测结果是具有较好的一致性，并且多重实时荧光定量PCR法中的敏感性为84.0%，特异性更是高达94.4%阴性预测值比阳性预测值高出更多，高达97.9%，而阳性预测值仅为65.6%。结论：使用多重实时荧光定量PCR法进行检测有着特异性好、稳定性好以及灵敏性高等等优势，能够在为高危型人乳头瘤病毒的患者提供一个更好的诊断方案以及技术平台。

关键词：多重实时荧光定量PCR；高危型人乳头瘤病毒；E6/E7mRNA检测

高危型人乳头瘤病毒（hrHPV）对人体有着较大的不良影响，其中就对人体宫颈癌的发生有着紧密的关联。并且根据相关的数据统计，hrHPV病毒的感染，是导致全球95%患有宫颈癌患者的必要条件和因素。在对患者的检查过程中，通过HPV DNA进行检测，是有着一定的敏敏行的，但是在研究分析中却发现其临床特异性却比较低，那么这也就意味着在诊断的过程中也会有着一定的不足。但是如果使用E6/E7mRNA的检测来进行病毒以及疾病的检测，就能更好的在临床的检查与诊断中，更加快速、准确的进行判断，从而更好的做出相关的预测并及时进行治疗。在此次的研究中则是通过多重实时荧光定量PCR来探究出一个更加快速与准确的检测方法，来为宫颈病变提供更好的临床技术。

1资料和方法

1.1资料分析

此次研究中选取我院223例临床样本进行检测与分析，来对患者进行HPV的检测，并且这些患者还需要进行试剂盒的筛选，筛选的结果为14种高危亚型阳性，临床样本患者的年龄处于25～79岁之间。在对患者的样本进行采集之后需要及时的放置于2～8度的环境之下进行保存，并且需要在72小时之内完成相关的检测工作。

1.2仪器和试剂

在研究中使用的仪器包括有数字PCR仪器、荧光定量PCR仪器，使用的试剂主要HPV DNA筛查试剂、DNA/RNA试剂盒、HPV检测系统、数字PCR试剂等等，在实验中所使用的引物以及探针等等都是有上海生工公司所制作合成。

1.3研究方法

在研究中使用的研究方法主要有六种，分别是薄层液基细胞学检测方法、宫颈组织病理学检测方法、HPV E6/E7mRNA检测方法、Aptima HPV检测方法、一步法MRT-PCR检测方法、一步法MRT-PCR灵敏度与特异性的检测方法等等。

1.4统计学方法

 在统计分析中应用Kappa检测的方法进行统计，所检测出来的值来去判断检测结果中是否存在着一致性的问题如果在统计分析中Kappa的值是等于或者超过0.75，那么这就表示检测的结果的一致性是相对较好的，如果Kappa值是小于0.75，并且大于等于0.4，那么就意味着检测结果的一致性是一般的，如果Kappa的值是小于0.4的，那么就意味着检测结果的一致性比较差。

2结果  

2.1MRT-PCR检测的灵敏度与特异性分析

在检测中使用14中hrHPV的标准品来作为检测的模板进行检测，在对PCR的检测中发现其中最低检测值的包括有9种类型，分别是HPV16、18、31、33、35、39、45、66、68等低至10copies/uL；其中剩下的5种类型检测值则是低至100copies/uL。在使用MRT-PCR检测方法中，通过对高危型以外的相关女性生殖道进行检测，检测出其中还存在着其他的病原体，并且检测的结果都成阴性，检测特异性也有着良好的表现。检测的结果如下图所示：

图1 多重实时荧光定量PCR检测HPV16RNA的敏感性

2.2 TCT检测和组织病理学诊断

在检测的过程中通过对223例临床样本实施TCT检测以及组织病理学诊断，其诊断与分析的结果如表1所示：

表1 组织病理学诊断结果

宫颈病变程度	TCT检测	组织病理学检测
正常	198	196
CIN 一/（ASC-US+LSLL）	16	18
（CIN 二+CIN三）/HSIL	7	7
>CIN 三/SCC	2	2

2.2 2中HPV E6/E7mRNA检测方法比较

在检测的过程中使用HPV E6/E7mRNA检测方法其检测的结果如下表所示，并且在对照这两种检测结果的对比分析中能够了解到其Kappa的值是91.0%。

表2 MRT-PCR与Aptima HPV分组情况

MRT-PCR	Aptima HPV		合计
	阳性	阴性
阳性	30	2	32
阴性	3	188	191
合集	33	190	223

3讨论

在当前对于HPV的检测方法已经存在有许多种，而当前最新并且是得到批准的检测方法是美国的Aptima HPV Assay的检测方法，但是在我国的国内却并没有较大的进行普及，而使用其他的HPV检测方法进行检测最多只能够检测出5种E6/E7mRNA。那么在此次的研究中，使用MRT-PCR的检测方法有着较高的实用性，并且在检测中还有这操作便捷、检测时间短等等极大的有点，并且通股MRT-PCR的检测方法对223例临床样本进行检测的结果中也显示出，其检测的结果对比具有较好的一致性，除此之外，将检测结果与组织病理学检测结果进行对比分析之下能够了解到，检测出来的阳性检出率也在逐渐的提升。

综上所述，在此次的研究中建立HPV E6/E7mRNA的检测方法，其高度的灵敏性以及特异性等等都对临床的诊断与治疗发挥这重大的价值，能够为医院的进行宫颈病变筛查的工作提供一个更加可靠与有用的手段。

参考文献：

[1]褚宏雁．HPV 感染与宫颈癌及癌前病变相关性临床分析［J］．中国社区医师( 医学专业) ，2013，15( 4) : 153-154．

[2]万雅丽，黄丹丹，郭英，等． 人乳头瘤病毒持续性感染与子宫颈癌的研究进展［J］． 现代妇产科进展，2020，29( 9) : 703-705．

[3]吴泽妮． HPV 病毒 DNA 载量、mRNA 和 E6 癌蛋白与宫颈癌及癌前病变的关系［D］． 北京: 协和医学院，2016．

[4]黄杰，王菲菲，徐超，等．人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品在评价人乳头瘤病毒核酸检测试剂中的应用［J］．药物分析杂志，2013，33( 12) : 2043-2046．