基于液相色谱法测定保健食品中叶酸

姚建菊

摘要：液相色谱法是指通过已知标准对照定性对未知物定性结果进行分析的一种以液体为流动相的色谱检测法。目前，我国正在积极的建立能够测定保健食品中叶酸含量、具有较高精密度和准确度等特点的操作流程简单的高效液相色谱法。本文旨在基于液相色谱法，从材料与方法、结果与讨论两方面来对保健食品多维康胶囊中的叶酸含量进行测定和分析。

关键字：液相色谱法；保健食品；叶酸

引言：叶酸是能够促进骨髓中的幼细胞成熟、预防胎儿神经管畸形、降低妊娠高脂血症发生危险的一种在制造核酸中扮演重要角色的水溶性维生素，摄入过量会影响人体对锌的吸收，从而产生毒性，影响胃肠道消化，摄入过少则会出现胎儿发育延缓等不良情况。因此，使用液相色谱法对保健食品中的叶酸含量进行测定，具有重要的研究和分析价值。

1材料与方法

1.1实验试剂与设备

本实验主要应用美国安捷伦公司创建的高效液相色谱系统、美国密理博公司研发的超纯水处理系统、日本资生堂公司生产的长度为5微米、尺寸为150×4.6毫米的色谱柱、我国目前最大的专业研发与制造企业出产的超声仪器、梅特勒公司研发的酸度计和电子分析天平等设备仪器。

本实验采用高效液相色谱法来对保健食品多维康胶囊中的叶酸含量进行测定，因此所需试剂主要有：纯度为99.4%的叶酸标准品、色谱纯甲醇、浓度为5%的分析纯氨水、去离子水、磷酸二氢钾粉末、氢氧化钾溶液、去离子水以及规格为500毫克/粒的忘不了多维康胶囊等。

1.2实验方法

1.2.1提取方法的选择

本实验的提取方法：以浓度为0.5%的氨水溶液作为提取溶液，将超声时间设置为20分钟，全程采取避光操作。

通过对叶酸特性的科学分析，可以得出叶酸在偏碱性溶液中具有良好溶解度以及稳定组分这一特点，因此，为了有效规避其他水溶性维生素的干扰，充分提取叶酸组分，在配置溶解样品的溶液时，需要选择浓度为0.5%的氨水溶液来配制偏碱性溶液；通过对叶酸特性的科学分析，可以得出叶酸具有光敏性，因此，本实验需要全程在避光条件下进行，且量瓶和进样小瓶均需采用棕色；通过比较不同超声提取时间所获得的提取结果，可以得出当超声提取时间为20分钟时，样品的待测成分能够基本实现完全溶解。

1.2.2标准品对照溶液的制备

对纯度为99.4%的叶酸标准品进行测量值精确至所取重量的千分之一的精密称定，使用浓度为0.5%的氨水溶液将其溶解并配制成质量浓度约为300微克/毫升的储备溶液。精密称量出3毫升的储备溶液放置在规格为100毫升的容量瓶中，加入适量去离子水稀释至刻度线，将其配制成含有约为9微克/毫升质量浓度叶酸的标准品对照溶液。

取5个规格为50毫升的容量瓶，分别置入精密称量出的7.46毫克、11.12毫克、14.89毫克、19.03毫克以及22.71毫克的纯度为99.4%的叶酸标准品，依次加入浓度为0.5%的氨水溶液，适量摇晃至溶解，再加入去离子水稀释至刻度线并充分摇匀，再分别精密称量出3毫升溶液放置在规格为100毫升的容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度线并充分摇匀，从而实现经过多次稀释获得含有50%、75%、100%、125%和150%制剂标示量浓度叶酸的线性标准品对照溶液。

1.2.3样品溶液的制备

取样品约20粒，倒出内容物粉末，对其进行测量值精确至所取重量的千分之一的精密称定，按照说明书规格对精密称取的适量粉末的叶酸含量进行计算，大致约为225微克。

将样品粉末放置在规格为25毫升容量瓶内，向其中加入15毫升0.5%浓度的氨水溶液，然后利用超声仪进行20分钟的超声处理，实时摇晃容量瓶直至样品粉末溶解，待容量瓶和溶液温度与常温一致，向容量瓶中加入去离子水至刻度线，摇晃摇匀后使用直径为0.22微米的微孔滤膜进行过滤，最后获得的滤液就是实验所需的样品溶液。

1.2.4色谱条件的制备

色谱条件的制备需要对色谱柱、流动相、流速、检测波长、色谱柱温度、进样体积等参数进行规范化设计。

流动相需设置为磷酸二氢钾-甲醇溶液，该溶液的配置过程：称取出6.8克的磷酸二氢钾粉末与70毫升的规格为0.1摩尔/升的氢氧化钾溶液，并加入去离子水将其稀释至850毫升并充分摇匀，在该过程中将其pH值维持在6.3，然后加入80毫升甲醇，再次加入去离子水将溶液稀释至1000毫升。 

由图1所示，通过多次验证和优化色谱条件，能够得出：当色谱具备以磷酸二氢钾-甲醇溶液为流动相、流速为0.8毫升/分、检测波长为254纳米、色谱柱温度为30摄氏度、进样体积为10微升等条件时，叶酸的色谱峰与其他组分之间具有良好的分离度[1]，且样品中的其他成分不会对叶酸的测定产生干扰。

图1 标准品对照溶液、样品溶液以及空白溶液的色谱图

2结果与讨论

对叶酸线性标准品溶液连续取样和进样6次，能够计算出叶酸色谱峰的峰面积的平均相对标准偏差为0.02%，符合相关标准，且说明仪器的精密度良好。

分别精密吸取10微升不同浓度的线性标准品对照溶液线性标准品溶液，将其注入液相色谱仪，在最佳色谱条件下进行叶酸含量测定，用Y来表示测定峰面积，用X来表示溶液的质量浓度，制作出标准曲线，再对其进行线性回归，获得回归方程结果为：Y=11.431，X=0.8778，线性相关系数r=１。该结果表明：该实验方法具有良好线性关系[2]。

表1 样品叶酸含量测定结果

	样本1	样本2	样本3	样本4	样本5	样本6
取样量/克	1.2688	1.2706	1.2746	1.2748	1.2747	1.2762
叶酸含量测定结果/（微克/粒）	83.71	83.73	83.00	86.55	86.34	88.42
叶酸含量平均测定结果值/（微克/粒）	85.29
相对标准偏差/%	2.50

如表1所示，独立制备6份样品溶液，分别进行进样分析，通过计算得出叶酸含量平均测定结果值为85.29微克/粒、相对标准偏差为2.50%。此结论说明该试验方法具有良好的可重复性。

结语：综上所述，也算作为人体不可或缺的重要营养组成，在各种保健食品中都有添加。本文主要就可以有效减少抗生素等其他因素对测定结果干扰的、操作步骤简单且分离效果好的、能够准确测定叶酸含量的液相色谱法进行研究和讨论，从而实现对该实验的实验材料、实验过程、验证方法以及对结果的科学分析等方面的科学合理搭建，为保健食品的质量控制提供有力的参考和保障。

参考文献：

[1]国梅,张舟艺,徐水祥,李跃中,孙丽华. HPLC法测定保健食品中叶酸含量及稳定性研究[J]. 分析仪器,2019,(01):153-156.

[2]满夏夏,高豪,闫陆飞,张益娟,孙朝霞,韩渊怀,侯思宇. 高效液相色谱测定小米中叶酸含量方法优化[J]. 中国农业大学学报,2020,25(12):111-121.