受精早期脱颗粒细胞对受精及胚胎发育结局的影响

李青洋,赵丽,蔡昭炜,刘容菊,邓少婷,陈雪梅,陈博

摘要 目的：探讨受精早期脱颗粒细胞对胚胎发育的影响。方法：回顾性分析2015年1月至2021年5月在本中心行体外受精并进行早期脱颗粒细胞助孕的患者311例，将同一患者的卵母细胞分成早期脱颗粒细胞组和过夜受精组，比较两组的受精及胚胎发育结局。其中，早期脱颗粒细胞组共2889枚卵母细胞，过夜受精组共3220枚卵母细胞。结果：早脱颗粒细胞组的多精受精率、0PN率、空透明带出现率显著高于过夜受精组（10.35% VS 8.85%；3.63 %VS 2.54%；1.1% VS 0.56%），但2PN率和1PN率差异不显著；两组的卵裂期发育各项指标无显著性差异；过夜受精组在D5可用囊胚率上显著高于早脱颗粒细胞组（24.96% VS 20.84%），D6优质囊胚率则显著低于早脱颗粒细胞组（4.66% VS6.47%），两者的D5优质囊胚率和D6可用囊胚率差异不显著。结论：受精早期脱颗粒细胞在受精结局及胚胎发育中并未体现优势。因此，不宜将患者全部卵母细胞行受精早期脱颗粒。

关键词：早期脱颗粒细胞，受精结局，胚胎发育

在体外受精（IVF）中，过夜受精为传统的且常用的受精方式，但受精后第二天发现受精失败再行补救措施，会导致胚胎结局不佳。但在受精早期，即精卵共孵育6小时左右时，通过去除颗粒细胞以观察第二极体是否排出可预测卵母细胞的受精情况；若未观察到第二极体，此时行补救措施，可预防受精障碍[1]。一项精卵孵育的荟萃分析表明[2]：各研究的受精早期脱颗粒的时间不一致，如受精后1至6小时，可能导致的脱颗粒细胞难易程度差异，进而影响了卵母细胞所受吸卵针的压力差异；而需要添加在卵母细胞周围的精子数量及受精时使用的培养皿不统一，可能导致培养液中精子代谢物浓度不一致，或患者的纳入标准不一致。所以，受诸多因素的影响，各研究有不一样的结论。因此，本研究通过同源卵母细胞行受精早期脱颗粒细胞及过夜受精脱颗粒细胞的对比，可排除以上所述的混杂因素影响，从而探讨受精早期脱颗粒细胞对胚胎发育的影响。

1、资料和方法

1.1研究对象 为2015年1月至2021年5月在本中心进行体外受精助孕患者。纳入标准：①原发不孕或不育3年及以上、人工授精2次治疗以上未妊娠，或男方精液检查结果为中度少弱畸精；②获卵数≥10 枚。本研究采用将同一患者的卵母细胞分成2组并进行自身对比。

1.2促排卵方案及取卵 采用长方案或拮抗剂方案。根据血清性激素水平及卵泡发育情况决定患者肌注人绒毛膜促性腺激素（hCG）的日期，肌注后36～37小时进行取卵，取出的卵母细胞放入受精四孔皿，置于37℃，6%CO2培养箱中，待4小时后进行受精。

1.3精液处理 采用双层密度梯度离心法合并上游法，将精液加入密度梯度液上方，500g离心15min后弃上清；沉淀的精子洗涤一遍后上游，吸取最上层上游精子0.3～0.5ml，转入离心管中待受精。

1.4受精 四孔皿中每孔精子的添加浓度为5～6×104/ml。精卵共孵育4小时后，早脱颗粒细胞组（早脱组）中用巴氏吸管随机吸取不超过总卵数一半的卵母细胞进行脱颗粒细胞操作，若＞30%的卵母细胞出现第二极体则认为该患者没有受精障碍，将其置入新的受精液中；过夜受精组（过夜组）则将剩余卵母细胞继续与精子共孵育至18～19小时后再行脱颗粒细胞处理。两组的卵母细胞一同转至胚胎培养液后观察受精情况。

1.5胚胎评分 在胚胎培养的第二天、第三天（D3）、第五天（D5）和第六天（D6）分别对胚胎/囊胚进行评分。D3胚胎评分标准：Ⅰ级-卵裂球大小均匀且碎片＜10%；Ⅱ级-卵裂球大小均匀且碎片10～20%；Ⅲ级-卵裂球大小不均匀且碎片≤20%；Ⅳ级-碎片20～50%；Ⅴ级-碎片≥50%。卵裂球数量＞5且碎片≤20%被认定为可用胚胎；7～9个卵裂球的Ⅰ～Ⅱ级胚胎为优质胚胎。囊胚评分标准则根据Gardner的评分方法进行评分。

2、统计学分析

采用Excel软件进行统计分析，受精及胚胎发育结局采用卡方检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

3、结果

本研究共纳入311位患者，共获得6109枚卵母细胞：早脱颗粒细胞组2889枚，过夜受精组3220枚。对其中237位患者行囊胚培养，其余患者行D3全胚冷冻。

表1 患者基本情况
人数	311
女方年龄	30.67±4.4
不孕年限	4.49±2.99
不孕因素	—
输卵管因素	190
子宫内膜异位	5
排卵障碍	26
少弱畸精	56
不明原因	27
高龄	7

3.1、受精结局比较

两组的卵母细胞成熟率（MII）基本一致；正常受精率（2PN率）和单原核率（1PN率）差异不显著，但多精受精率（≥3PN）差异显著；除此之外，我们还发现0PN率（原核观察当天仅见两个极体未见原核，但第二天卵裂的胚胎）及空透明带现象在统计学上也差异显著（表2）。

表2 受精结局比较
	早脱组/%	过夜组/%	p值
MII	87.3 (2523/2889)	87.5 (2819/3220)	0.79
2PN	63.96 (1848/2889)	64.4 (2075/3220）	0.70
≥3PN	10.35 （299/2889)a	8.85 (285/3220)b	0.047
1PN	3.18 (92/2889)	3.88(125/3220)	0.14
0PN	3.63 (105/2889)a	2.54(82/3220)b	0.01
空透明带	1.1 (32/2889)a	0.56(18/3220)b	0.02

3.2、卵裂期胚胎发育结局比较

胚胎发育速度：两组的D2胚胎形成率、D3胚胎形成率、4-8细胞形成率均无显著性差异。胚胎质量：D3可用胚胎率和优质胚胎率也差异不显著（表3）。

表3 卵裂期胚胎发育比较
	早脱组/%	过夜组/%	p值
D2胚胎形成率	57.5（1063/1848)	57.7 (1198/2075)	0.9
4-8细胞形成率	28.6 (528/1848)	28.9 (601/2075)	0.8
D3胚胎形成率	34.96 (646/1848)	34.47 (711/2075)	0.7
D3可用胚胎	83.71(1547/1848)	82.7(1716/2075）	0.4
D3优质胚胎	26.03 (481/1848)	25.83 (536/2075)	0.9

3.3、囊胚发育结局比较

D5囊胚形成率上，过夜组高于早脱组，差异显著，但D5优质囊胚率差异不显著；过夜组D6囊胚的形成率略低于早脱组但差异不显著，而D6优质囊胚形成率差异显著（表4）。

表4 囊胚期发育结局比较
	早脱颗粒细胞组/%	过夜受精组/%	p值
D5可用囊胚	20.84（264/1267)a	24.96 (343/1374)b	0.01
D5优质囊胚	15.63 (198/1267)	17.32(238/1374)	0.24
D6可用囊胚	12.47 (158/1267)	10.7(147/1374)	0.15
D6优质囊胚	6.47 (82/1267)a	4.66 (64/1374)b	0.04

4、讨论

对受精早期脱颗粒细胞影响的研究，无论是在受精、胚胎发育或妊娠结局上仍存在争议[3]。因此，本研究利用同源卵母细胞进行随机分组以排除个体差异的影响。

我们的观察显示：受精方面，受精早期颗粒细胞组的多精受精发生率较高。其发生原因可能是：受精时精子穿透卵母细胞，卵母细胞即恢复第二次减数分裂，纺锤体和微管的活动较为活跃，此时卵母细胞的细胞骨架活动更容易受到外界的机械力干扰，而卵母细胞刚取出体外时被颗粒细胞紧密围绕，与受精过夜相比，受精早期颗粒细胞更难去除，需要的多次抽吸和吹出操作，可能使减数分裂出现异常，从而导致多原核现象[4]。与大部分文献报道不同，我们的研究还发现早脱颗粒细胞组0PN的发生率也较高。0PN为原核消失，这是第一次卵裂前经历的过程之一。受精卵发生第一次卵裂之前雌雄原核的靠近依赖于细胞骨架网络，当雌原核靠近雄原核时，两个原核周围都各自出现一个星体微管，形成第一个有丝分裂纺锤体的两极，第一个有丝分裂纺锤体出现[5]。由此可见从受精到第一次卵裂发生了一系列复杂事件，但可能因为早期除颗粒细胞时的吹吸操作引起的高速涡流干扰了核和细胞骨架对细胞周期的调控，导致原核提前消失，快速进入第一次有丝分裂。我们的研究还发现早脱颗粒细胞组中空透明带的几率也升高，可能因为受精早期的颗粒细胞包裹较为紧实，脱颗粒时较多的吹吸次数，使卵母细胞受到了更多的机械应力损害，从而导致部分卵母细胞透明带破裂。我们的研究没有发现早脱组和过夜组的正常受精率之间存在差异，但因异常受精等不良情况发生率偏高，侧面反映早期脱颗粒细胞在受精结局上并无优势。

胚胎发育方面，本研究发现早脱组和过夜组的卵裂期胚胎无论是发育速度还是胚胎质量上均表现为差异不显著。在囊胚阶段，过夜组在D5形成的可用囊胚较多，差异显著；但D6的可用囊胚及优质囊胚低于早脱颗粒组，可能因过夜组在D5已形成较多可用囊胚，致使D6的可用囊胚及优质囊胚形成率不及早脱组，但因D5囊胚的整倍体率及移植成功率高于D6囊胚，D5的囊胚更应被重视[6]。我们观察得出胚胎发育结局在早脱组未见明显优势，这可能跟精卵共孵育时的精子浓度有关。有研究得出短时受精的胚胎发育优于过夜受精，因为在这些研究中，受精的精子浓度往往较高（5～10×106/ml）[7]，精卵经18～20小时共孵育后，卵母细胞周围累积了由高浓度精子产生的更多活性氧物质及较多的死亡精子，对过夜受精中卵母细胞的发育潜能产生了不良影响[8]。而我们的研究添加相对较低的精子浓度（5×104/ml），其精子代谢废物的浓度较低可能不足以影响过夜受精后卵母细胞及后期胚胎发育[9]，因此，受精时的精子浓度可能比孵育时间更为重要。

受精早期脱颗粒细胞的唯一目的是为了预防受精障碍，而这对于受精能力良好的患者而言存在一定程度的过度治疗。因此，根据本研究的观察结果，建议受精障碍的高危患者取2～5枚卵母细胞行早脱颗粒细胞，在保证有受精卵的情况下，不宜将其余卵母细胞的颗粒细胞去除。本文仅从胚胎发育角度对受精早期脱颗粒细胞的影响进行了分析探讨，后续还会对妊娠结局及出生子代进行进一步的研究。

参考文献

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基金：东莞市社会科技发展（一般）项目（202050715024885）

第一作者：李青洋，东莞市松山湖中心医院生殖中心，硕士，助理研究员。