酶解法提取藤茶中二氢杨梅素的工艺优化

安丰田王剑苏家茹

摘要:本文通过酶解法来提取藤茶中的二氢杨梅素，并通过紫外-可见分光光度法测其含量。对酶解法的各影响因素进行单因素试验，并通过正交试验对提取工艺进行了优化。结果表明酶解法提取的最佳工艺条件为：酶解温度为50℃，酶解时间为3个小时，酶用量为6mg，pH为4.5。此条件下二氢杨梅素的提取率为33.37%。该工艺稳定可行，为藤茶中二氢杨梅素的提取开辟了新途径。

关键词：藤茶;二氢杨梅素;提取工艺;正交试验

Abstract:Dihydromyricetinwasextractedfromampelopsisbyenzymatichydrolysisextractionmethodanddeterminedbyultravioletspectrophotometricmethod.Theinfluencefactorsofenzymatichydrolysissinglefactorexperimentwascarriedoutandtheextractionprocesswasoptimizedbyorthogonaltest.Thebestextractiontemperature,extractiontime,enzymedosageandpHvaluewere50℃，3h，6mgand4.5，respectively.Underthiscondition,theextractionyieldofdihydromyricetinwas33.37%.Thismethod，whichisstableandfeasible,haveopenanewavenuesofresearchfortheextractofdihydromyricetinfromampelopsisgrossedentata.

Keywords:Ampelopsisgrossedentata;Dihydromyricetin;Extractionprocess;Orthogonaltest

藤茶,植物学名显齿蛇葡萄野生藤本植物[Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang],主要分布于我国湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地,在湖南、湖北等省已有一定规模的人工栽培[1,2]。藤茶为药食两用植物,最初作为一剂草药应用于民间[3]。因其外观和冲饮的口感特征,而有“白猴”、“甘露茶”、“茅岩霉茶”、“野藤茶”、“龙须茶”等俗称[4,5]。全株药用,味甘、淡、性凉,具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等功效。目前已对藤茶的化学成分进行了比较系统的研究，为藤茶的开发利用提供了理论基础。到目前为止已经分离出数十种化合物。目前对藤茶的化学成分研究主要集中在黄酮类化合物，黄酮类化合物为藤茶的主要成分，也是藤茶的主要活性成分，主要包括二氢杨梅素（dihydromyricetin）和杨梅素。二氢杨梅素的结构式如下图所示：

植物黄酮类化合物的提取,以溶剂浸提法为主[13]。在溶剂浸提的基础上,辅以超声波、微波手段,以强化提取效果。藤茶中的两种主要黄酮成分均属多羟基黄酮醇类化合物,具极性,易溶于热水、乙醇等,迄今为止,对藤茶黄酮,尤其是二氢杨梅素的提取,以热水提取、乙醇回流提取为主,以超声波或微波加以辅助。传统的提取分离法存在着有效成分提取率低、杂质清除率低，能耗高、生产周期长等缺点，使天然药物提取工艺的发展受到制约。随着工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术不断被应用到天然药物生产中，尤其是酶技术不断在天然药物行业得到应用，酶解技术在天然药物提取中能显著提高目标成分的浸出率，比传统提取方法具有明显的优势。

本文以纤维素酶酶解藤茶叶细胞壁，采用热水浸提法提取藤茶中总黄酮物质。藤茶中总黄酮以二氢杨梅素得率为指标单因素实验条件，并进一步研究了酶量、温度、时间、PH等因素四因素三水平正交实验，对提取工艺条件进行了优化，得出一条最佳的提取工艺。

1实验部分

1.1实验材料

1.1.1实验仪器

DJ_200A型电子天平（亚太电子天平厂）；电子万用电炉（北京中兴伟业仪器有限公司）；SHZ-D(iii)型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；超声清洗机（宁波市海曙达胜超声波仪器厂）；玻璃砂芯过滤过滤装置（上海新亚净化器件厂）；SPD-20A-230V型高效液相色谱仪（岛津制造所）。

1.1.2实验原料与试剂

藤茶叶（贵阳省农科院提供）；二氢杨梅素标准品（纯度>98%）(上海佳和生物科技有限公司)。

无水乙醇（AR，重庆川江化学试剂厂）；丙酮（AR重庆川江化学试剂厂）；甲醇（DK，重庆川江化学试剂厂）；磷酸（AR，天津市登科化学试剂有限公司）；Alcl3（AR成都市科龙化工试剂厂）；冰醋酸（AR，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；无水乙酸钠（AR，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；纤维素酶(北京东华强盛生物科技有限公司)；

水为蒸馏水。

2实验方法

2.1二氢杨梅素含量的测定

2.1.1二氢杨梅素样品液制备

称取藤茶5g,加入一定量的纤维素酶在一定温度，一定PH浸泡一定时间，然后再沸水中热提取，趁热用100目的双层滤布过滤，收集滤液，95%乙醇100ml定容备用。

2.1.2对照品的制备

精密称取二氢杨梅素标准品4.169mg,于100ml容量瓶中加95%乙醇充分震荡溶解得得41.69μg/ml二氢杨梅素标准液备用。

2.1.3测定波长的选择

精确量取0.3ml二氢杨梅素标准液加入10ml的容量瓶中，准确加入3mL5%ALCL3，用95%乙醇定容至刻度，混合摇匀，室温放置40min，空白组以3mL5%ALCL3，用95%乙醇定容至刻度。在200—400nm范围内扫描,所得结果见图1。

2.1.4标准曲线的制备

取洁净的10mL容量瓶，用移液枪准确量取按2.2.2制备的二氢杨梅素标准品对照液1mL,1.5mL,2mL，2.5mL,3mL,准确量取3mL5%ALCL3加入容量瓶，用95%乙醇定容至刻度，混合摇匀，室温下放置40分钟，按2.2.3测定的最大吸收波长，测吸光度，以二氢杨梅素对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，所得结果见图2。

2.1.5重复性试验

按绘制标准曲线的测量方法，分别准确量取待测样品液4份，测定标准液的吸光度。所得结果见表1。

2.1.6稳定性试验

准确量取待测样品液，按绘制标准曲线的测量方法，每隔半小时测定其吸光度，共测四次。所得结果见表2。

2.1.7样品中二氢杨梅素含量测定

准确量取1mL上述样品液注入100mL容量瓶中95%乙醇至刻度，然后从中量取1mL注入100mL容量瓶中95%乙醇至刻度，再从中量取0.4mL注入10mL容量瓶中，按上述测定吸光度方法在最大吸光度处测定其吸光度。

2酶解法提取二氢杨梅素正交实验

运用L9（34）正交表，进行酶解温度，时间，PH值，酶用量四个因素三个水平的正交实验，确定酶解法提取二氢杨梅素的最佳提取工艺。所得结果见表3、表4。

3结果讨论

3.1波长选择

最大吸收波长的选择由图可知样品和对照品的吸收图谱一致，都在311nm处有最大吸收，因此选择检测波长为311nm.

3.2标准曲线的绘制

经测得二氢杨梅素标品吸光度如图表2所示，以吸光度纵坐标Y,标品浓度为横坐标X进行作图，得回归方程Y=0.0608X+0.0039,R2=0.9990,标准曲线见图2。结果表明二氢杨梅素在4.169-12.507μg/ml范围内与吸光度呈良好线性关系。

3.3二氢杨梅素重复性实验

从表中我们可以看到根据正交结果所确定的最佳提取工艺相对稳定，以最佳提取工艺提取得的藤茶中二氢杨梅素的平均得率为33.37%。因此确定二氢杨梅素的最佳提取工艺是：准确称取藤茶5g于烧杯中，加入纤维素酶6mg，调节pH为4.5，放入温度恒定为50℃的水浴锅中反应3个小时。用100目的双层虑布过滤，收集滤液，结晶、重结晶得到固体。

4结论

本文用纤维素酶分解藤茶叶细胞壁，使藤茶叶中的二氢杨梅素溶解出来。通过对酶解温度，酶解时间，酶用量和pH几个因素进行了单因素试验和正交试验来探寻最佳工艺条件，得出的最佳参数为：酶解温度为50℃，酶解时间为3h，酶用量为6mg，pH为4.5。相比于之前研究的热水提取法而言，该方法高效且更加节约能源，藤茶中的二氢杨梅素提取率为33.37%，高于热水浸提法，该方法为藤茶中二氢杨梅素的提取提供了一条新思路。

参考文献

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