乳腺组织快速冰冻制片经验浅析

张晓妹王琳仇玮

（南京医科大学附属江宁医院病理科江苏南京210000）

【摘要】目的：乳腺组织中因含较多脂肪，在冰冻制片过程中极易脱片，本文重点就乳腺组织冰冻制片的经验进行浅析总结。方法：以乳腺组织的取材包埋、切片、固定及染色等过程为要点，对每个环节的影响因素进行浅析，并重点总结应对措施。结果及结论：按本文之经验方法制作的乳腺快速冰冻切片，能够最大程度降低脱片概率，并能保持乳腺组织结构的完整性，胞核胞浆等染色清晰、对比度良好，同时切片平整、无组织重叠等，能较好的满足临床病理诊断的要求。

【关键词】冰冻切片；乳腺组织；病理诊断

【中图分类号】R446.8【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）11-0391-02

外科疾病，尤其是肿瘤的分型诊断与外科手术方案紧密相关。然而仅仅依靠CT、B超等常规辅助检查手段往往不能确切区分肿瘤性疾病的病理类型，因此许多外科疾病通常需要依靠术中快速冰冻诊断来明确，并进一步指导手术方案的确定。所谓冰冻制片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。近年来，随着外科手术的发展，需要依靠冰冻诊断的病例有日益增多的趋势。不仅如此，在科研实践中，由于常规病理制片耗时较长、步骤繁琐，因此快捷、简便的冰冻制片在动物疾病诊断中的应用也日趋增多。在本科近万例的冰冻制片中，我们发现各组织因结构组成不同，适宜的切片条件也不尽相同。其中乳腺冰冻因脂肪组织较多，有时伴坏死和或钙化，极易引起切片碎裂、脱片，有时还会出现染色后组织结构不清等诸多问题。针对这些问题，本文将重点就乳腺组织冰冻制片的经验进行浅析总结。

1.材料

ThermoCryotomeFSE型冷冻切片机，LEICA冰冻切片刀，Thermo冰冻切片包埋剂（OCT，opti-mumcuttingtemperaturecompound）；苏木素染液、乙醇、伊红、二甲苯等为国产试剂。

2.方法浅析

2.1制片准备

为了确保工作时段冷冻切片机能够正常有效运转，日常的维护保养工作必不可少，如及时补充制冷剂、确保刀片锐利等。此外为了缩短制片过程中的冷冻时间，通行的做法是24h待机，提前1h开机预制冷。软毛刷、玻片、铅笔、镊子、OCT等材料也是需要提前检查、备好，避免制片时的材料缺失。

2.2取材

乳腺组织必须新鲜，不能浸泡生理盐水和固定剂。尽可能不用自来水清洗，水洗可导致组织含水量增加，易形成冰晶，不仅伤刀，而且会导致细胞肿胀变形，进而影响染色及诊断。此外取材时应尽量避开脂肪组织。取材大小厚薄应适中，因为组织过大过厚，可引起包埋不全；组织过小，易至修切过度。因此通常以1.2cm×1.2cm×0.2cm为宜，厚度尽量不超过0.4cm[1-2]。

2.3包埋

先倒少许OCT于样本托盘上，随即将组织置于其上，并加用OCT包埋组织。此种包埋方法可使组织得以较好的定位，同时后添加的OCT起到牵拉展开组织、防止切片皱褶产生的目的。另外OCT包埋过程中的小气泡应尽量去除，以免影响旁边组织挤压皱褶。

2.4切片

脂肪较多的乳腺组织质地较软、内含脂肪及空泡，所以冷冻温度必须较普通标本低，时间也要较长，一般温度为-25℃～-30℃，2min～3min为宜[3]。但同时应注意防止冷冻过度，此时切片呈碎末状，不过用拇指指腹轻压组织表面可缓解。切片厚度以5um为宜，切刀角度5度较为合适，并弃去前1～2张切片。具体切片操作时进刀要快，用力均匀。选择合适组织切片，用软毛刷按压切片前缘，防止切片卷曲、粘连、脱片等。

2.5固定

为防止脱片的发生，我们的经验是切片后放置温度均衡的烘片箱中数秒，如脂肪较多的片子可直接进行文火烘烤。放入固定液前先把组织与片子的粘贴处放在手背上数秒，使片子不宜过热增强温度差，使其结合更牢固。固定液的选择较为多样。其中以AAF固定液（95％乙醇85rnl、40％甲醛10ml、冰醋酸5rnl)）为常用、效果佳。实践证实AAF固定乳腺组织1min即可，小于1min固定不充分，时间过长影响制片速度。

2.6染色

经固定后的片子在新鲜配制苏木素染液中染色2～3分钟。流水冲洗后于盐酸水溶液中分化数秒，分化是整个染色过程中的关键，但时间宜过长，以切片呈淡红色为准。实践经验表明，对于易脱片的组织无需分化，最终也能使细胞核达到理想染色效果。此外返蓝以细胞核呈紫蓝色，胞浆及纤维组织无着色或浅色为宜[1]。另外氨水返蓝后温水冲洗可增加染色对比度和清晰度[2]。

3.小结

通过各种技术改进而制作的乳腺快速冰冻切片，能够最大程度降低脱片概率，并能保持乳腺组织结构的完整性，胞核胞浆等染色清晰、对比度良好，同时切片平整、无组织重叠等，能较好的满足临床病理诊断的要求。总之，冰冻制片技术是病理科最重要的常规工作之一。制作一张完整、优质的快速冰冻制片不仅需要高度的责任心，更要掌握关键性技术操作要领，以及丰富的工作经验。若切片质量差，势必增加术中快速诊断的风险，所以在日常的工作中还需要不断摸索经验提高切片质量，这样才能更好的服务临床。

【参考文献】

[1]孟黎明.冰冻诊断的意义及开放式冰冻制片技术的讨论.临床和实验医学杂志[J].2011,10(9):713-714.

[2]柳麦琴.冰冻制片中易遇到的问题及其应对措施.内蒙古中医药[J].2012,31(21):74.

[3]王秀萍.提高冰冻制片质量的方法探讨.航空航天医学杂志[J].2012,23(3):375-376.