玻璃酸钠对角膜上皮细胞生长的影响

袁振丽1郝冬海1汪卓2李博2

（1沈阳绿谷生物技术产业有限公司110163；2辽宁何氏医学院辽宁沈阳110163）

【摘要】目的比较含玻璃酸钠的盐酸左氧氟沙星滴眼剂与市售盐酸左氧氟沙星滴眼剂对角膜上皮细胞活力的影响。方法体外培养家兔角膜上皮细胞，采用MTT法进行角膜上皮细胞活力的检测，同时进行一般形态学观察。结果与空白对照组及市售盐酸左氧氟沙星滴眼剂组比较，含玻璃酸钠的盐酸左氧氟沙星滴眼剂组角膜上皮细胞连接紧密，生长状态良好。MTT结果显示，与市售盐酸左氧氟沙星滴眼剂组比较，含玻璃酸钠的盐酸左氧氟沙星滴眼剂组可显著提高细胞存活率。结论含玻璃酸钠的盐酸左氧氟沙星滴眼剂组与市售盐酸左氧氟沙星滴眼剂组比较，可显著促进角膜上皮细胞的生长。

【关键词】玻璃酸钠角膜上皮细胞MTT

【中图分类号】R969.4【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）24-0087-02

玻璃酸钠(sodiumhyaluronate，SH)为体内重要的生理活性物质，在眼科领域已得到了广泛的应用。目前研究表明SH作为滴眼剂的媒介不但起到保湿、润滑、提高生物利用度等作用，而且还具有抗氧化、促修复、降低滴眼剂中防腐剂不良反应等方面药理作用[1,2]。本研究应用MTT法观察含SH的盐酸左氧氟沙星滴眼剂与市售不含SH盐酸左氧氟沙星滴眼剂对角膜上皮细胞活力的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

健康新西兰大耳白兔（京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2009-0004），体重2.0～2.5kg，雌雄兼用。

1.2主要试剂及仪器

含玻璃酸钠的盐酸左氧氟沙星滴眼剂（沈阳何氏药业有限公司提供），盐酸左氧氟沙星滴眼剂（沈阳利祥制药有限公司），DMEM/F12、PBS、胰酶、胎牛血清（Hyclone），MTT（Gibco），DMSO（天津市博迪化工有限公司），洁净工作台（苏净安泰），CO2培养箱（Thermo），倒置相差荧光显微镜（OLYMPUS），培养皿、96孔培养板（Gibco）。

1.3角膜上皮细胞培养[3]

健康新西兰大耳白兔空气栓塞处死，无菌摘取眼球，生理盐水冲洗3次后用PBS缓冲溶液（含青霉素）浸泡30min。解剖显微镜下用刀片刮取角膜上皮层，置于塑料培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，置37℃，5％CO2培养箱中培养。7d后，细胞长成单层，用胰酶消化后加入新鲜培养液制成细胞悬液，计数，以1.0×105cells/mL接种于96孔板，培养细胞达80％融合度时进行实验。

1.4细胞活力检测及一般形态学观察[4]

实验分为对照组、样品组、市售标准品处理组，样品组加入100μL终浓度含100%，75%，50%，25%，5%的样品，市售标准品处理组加入100μL同样浓度的市售标准品，对照组加入等体积的DMEM/F12培养液，于37℃，5%CO2条件下孵育24h后，在倒置光学显微镜下进行一般形态学观察，采用MTT法在492nm处读取酶标仪OD值，计算细胞存活率。每组设6个复孔，实验重复三次。

1.5统计分析

实验数据以表示，应用SPSS16.0统计学软件One-WayANOVA检验，进行统计学分析，P<0.05代表有统计学意义。

2结果

2.1一般形态学观察

由图1可见，空白对照组长成连续单层，细胞呈不规则型、大小不均匀、排列比较稀疏。样品组长成连续单层，细胞呈六边形或不规则型、大小均匀、排列紧密。市售标准品组细胞近似六边形或不规则型，排列稀疏。与空白对照组及市售标准品组比较，样品组细胞紧密连接，生长状态良好。

图1角膜上皮细胞各处理组一般形态学观察。A：空白对照组，B：市售标准品组，C：样品组。

2.2样品与市售标准品对角膜上皮细胞活力的作用

由图2可见，当样品组与市售标准品组终浓度为25～100%时，与空白对照组比较，可见细胞有明显的损伤，这可能是由于左氧氟沙星与滴眼剂辅料在高浓度时的细胞毒性作用。当药物浓度降至5～10%时，与空白对照组比较，样品组与市售标准品组均可显著提高细胞存活率，且药物浓度在5%时，样品组与市售标准品组比较，样品组可显著提高细胞存活率。

图2样品与市售标准品对角膜上皮细胞活力的作用。*P<0.05，样品组、市售标准品组与空白对照组比较，△P<0.05，样品组与市售标准品组比较。

3讨论

SH是一种广泛存在于人及动物组织内的高分子酸性黏多糖，是构成细胞外基质的主要成分，在眼科领域主要用于人工泪液和内眼手术的黏弹物质[5]。很多药物均以SH为媒介，如润舒（氯霉素+SH）、角膜宁（硫酸软骨索+SH）、正大捷普（阿昔洛韦+SH）等，在滴眼剂中加入SH可通过增加药液的黏稠度，延长药液在眼内的滞留时间，提高药物的生物利用度，减轻药物对眼的刺激以及滴眼剂中防腐剂的毒性，促进眼部创伤的愈合[2,5]。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。试验所需显色剂MTT是一种能接受氢原子的显色剂，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，又称噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能选择性的还原外源性MTT为水不溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪测定其吸光度值。此方法特点是灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、经济，已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验等[6]。本研究结果表明含SH的盐酸左氧氟沙星滴眼剂与市售不含SH盐酸左氧氟沙星滴眼剂比较，在较低浓度SH存在时可显著提高角膜上皮细胞的存活率。提示含SH盐酸左氧氟沙星滴眼剂对角膜上皮细胞具有保护作用，可显著促进角膜上皮细胞的生长，其详细作用机制将在后续研究进行。

参考文献

[1]凌沛学,贺艳丽,白若琬,等.玻璃酸钠结构及理化性质的研究进展[J].中国生化药物杂志,2000,21（3）:151-4.

[2]唐细兰，叶成添，陈雷宇．玻璃酸钠在眼科的临床研究应用进展[J].中国生化药物杂志,2004,25（2）:123-4.

[3]任玫卿,栾洁.兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究[J].东南大学学报(医学版),2008,27（2）:90-94.

[4]MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays[J].JImmunolMethods.1983,65(1-2):55-63.

[5]张琛,王志昕.邓世靖等．防腐剂对兔角结膜上皮细胞毒性及玻璃酸钠保护作用的实验研究[J].眼科新进展,2008,28（2）:85-9.

[6]司徒镇强,吴军正.司徒镇强.细胞培养[M](第2版)．西安：世界图书出版公司,2007:1-2．