P物质在急性胰腺炎肺损伤大鼠模型肺组织中的变化

宋长满1侯晶1陈海龙2

（1辽宁省大连大学附属新华医院肛肠外科辽宁大连116021)

(2辽宁省大连医科大学附属第一临床医院辽宁大连116021）

【中图分类号】R563【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)12-0133-02

【摘要】目的本实验将通过观察P物质在重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤模型大鼠肺组织中的变化规律，来探讨重症胰腺炎病情的发展与P物质(SP)的关系。方法健康SD大鼠72只，体重220-280克，雌雄不拘，随机分为三组（SAP模型组，假手术组，清胰汤治疗组），每组24只。以胰胆管逆行注射1.5％的去氧胆酸钠溶液建立SAP肺损伤模型。采用ELISA法测定大鼠肺组织中SP含量；真空干燥法测定肺湿干重(W/D)比值；碘－淀粉比色法进行血清淀粉酶(AMY)含量测定，大体及镜下观察肺脏病理学改变。结果SAP模型各组与相同时间点假手术组相比：血清AMY水平、肺组织P物质水平、W/D值升高明显（P<0.01）；肺组织出现水肿、充血、中性粒细胞浸润和灶性肺不张等改变，清胰汤组与相同时间点SAP组相比：血清AMY水平、肺组织SP水平和W/D值降低（P<0.01）；肺组织病理改变明显减轻。结论SP参与SAP肺损伤的病理过程，清胰汤能通过减少肺组织中SP含量对SAP及相关肺损伤有治疗作用。

【关键词】重症急性胰腺炎肺损伤P物质清胰汤

1材料和方法

1.1实验动物和分组健康SD大鼠72只，体重220-280克（由大连医科大学动物实验中心提供），雌雄不拘，随机分为三组（SAP模型组，假手术组，清胰汤治疗组），每组24只。各组又分为6小时、12小时、24小时组，分别在造模后6小时、12小时、24小时剖杀取材。

1.2实验试剂及药品P物质定量ELISA试剂盒（深圳晶美生物制品有限公司），血清淀粉酶（AMY）试剂盒（南京建成生物工程研究所），清胰汤：茵陈20g、栀子20g、大黄20g、芒硝20g、木香15g、柴胡5g、元胡15g、白芍15g、甘草6g、双花20g、连翘20g，由大连医科大学第一附属医院中药局制成汤剂,其中大黄后下，芒硝冲用。参照人体用量，按系数折算出大鼠用量。

1.3实验过程和方法

1.3.1实验动物模型制备提前2周从实验动物中心提取大鼠，普通鼠料喂养，使其适应实验室环境，实验前12小时禁食，自由饮水。SAP模型组：10%的水合氯醛0.3ml/100g体重，腹腔内注射，麻醉成功后，大鼠仰卧位并无创固定四肢于试验台，腹部备皮，消毒铺巾，取剑突下腹正中切口，长约1.5厘米，进腹后沿幽门寻找十二指肠，将其提出切口外，暴露十二指肠胰胆管入口处，用无损伤动脉夹夹闭胰胆管近肝门处,用1号针头在十二指肠侧肠壁处穿刺缓慢注入1.5％的去氧胆酸钠溶液0.1ml/100g体重，1分钟注射完毕，注射后保持压力2分钟，观察胰腺水肿、充血等改变后，取出动脉夹，十二指肠复位，缝合切口，包扎固定，术毕。假手术组：腹部手术开腹后仅轻轻翻动胰腺，不经胰胆管给药。其他操作与SAP组相同。清胰汤组：在制模前2小时和制模后用清胰汤灌胃1次，1ml/100g体重，其他组灌等量生理盐水。清胰汤24小时组于第12小时再用清胰汤灌胃1次，其他24小时组灌等量生理盐水。各组又分为6小时、12小时、24小时组，分别在造模后6小时、12小时、24小时剖杀取材。

1.4观察指标及测定方法抗大鼠P物质单抗包被于酶标板上，大鼠标本中的P物质会与单抗结合。加入生物素化的抗大鼠P物质（二抗），它将与结合在单抗上的大鼠P物质结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。大鼠P物质的浓度与OD(450nm)成正比。血清淀粉酶采用酶法，由HITACHI自动生化分析仪测定。真空干燥法测定肺湿干重(W/D)。

2结果

2.1一般情况和死亡率各组大鼠6小时无死亡，12小时SAP模型组死亡1只，24小时SAP模型组死亡3只。24小时SAP模型组死亡率17%。对照组大鼠一般情况较好，SAP模型组大鼠一般情况差，出现精神萎靡、反应迟钝、懒动、竖毛、呼吸急促等表现。清胰汤组和假手术组一般情况较SAP模型组有所改善,术后恢复较快，精神状态和活动明显有所改善。清胰汤组一般情况较好。

2.2病理结果

2.2.1大体观察假手术组大鼠肺脏颜色鲜红，质软有弹性，胰腺透明度好，无充血无水肿，腹水量少或没有。SAP模型各组，肺脏均有不同程度的肿胀，表面见暗红色点状病灶，切面有淡红色或白色泡沫样液体溢出；胰腺表面呈暗黄色，质硬，粘连，胰组织呈胶冻状改变，轮廓消失，出血坏死灶明显；腹水量多，呈淡黄色偶见淡血色腹水，随时间的延长上述情况加重。清胰汤组也有上述变化，但程度较轻。

2.2.2HE染色观察肺组织石蜡切片，HE染色显示，假手术组肺组织结构清晰，间质血管无充血，肺泡腔内未见中性粒细胞浸润，偶见轻度水肿。SAP模型组大鼠肺间质炎性细胞浸润、出血、肺间质水肿，肺泡结构破坏。清胰汤组肺泡腔内炎性细胞浸润减轻，渗出减少。

2.3肺组织湿/干比值（W/D）的变化见表1。

表1肺组织湿/干比值的变化(mean±SD)

SAP模型组各组肺W/D值与相同时间点假手术组相比显著升高；清胰汤组与相同时间点模型组相比明显下降。

2.4血清淀粉酶（AMY）的变化见表2

表2血清淀粉酶的变化(mean±SD,U/g)

SAP模型组各组肺AMY较相同时间点假手术组显著升高；清胰汤组AMY数值较相同时间点SAP组明显下降。

2.5肺组织中SP的变化见表3。

表3肺组织中SP的变化(mean±SD,pg/ml)

模型组各组肺SP值较相同时间点假手术组显著升高；清胰汤组肺SP数值较相同时间点模型组明显下降。

3讨论

本实验采用ELISA法及免疫组化染色的方法测定肺组织中P物质的含量，结果发现肺组织中P物质含量在SAP模型的各组之间的差异也同肺的湿干比值结果变化趋势基本一致，随着时间的延长浓度显著增加。从病理结果看，大鼠胰腺和肺组织的出血、炎症、水肿也更加明显，并且出现肺泡塌陷、肺泡内浆液性渗出等，出现肺的正常结构破坏。我们的实验结果表明，P物质参与了PALI的发生机制，而且是其中重要的一个环节，是决定SAP及以肺损伤严重程度的重要因素。这就提示我们P物质在重症急性胰腺炎及其相关肺损伤中的作用不容忽视，为临床治疗SAP肺损伤提出了新的研究思路和方向。

中医认为SAP系由肝胆失疏、湿热蕴结之病机，进一步演变为热毒炽盛、瘀热内阻，或上迫于肺，或内陷心包，或热上血络所致。其病机之关键是“实热血瘀”，所以治法应以“通腑泄热，活血化瘀”。临床上中医中药治疗SAP疗效肯定，特别是清胰汤[1，2]，是治疗急性胰腺炎的有效药物，对于重症急性胰腺炎有良好的作用。清胰汤有通里攻下、活血化淤、清热解毒、疏肝理气等作用。方中大黄、芒硝通里攻下泻热，涤荡积滞，通畅腹气，使糟粕排出体外。在该方中通里攻下是主要治则。本实验结果显示：与SAP组相比，清胰汤各时间组血清AMY与肺组织中P物质含量明显降低（P<0.01）；肺组织的湿干比重明显降低（P<0.01），从肺组织的病理切片也证实了清胰汤组肺脏炎性渗出明显减少，间质水肿明显减轻。结果提示，清胰汤在治疗SAP时直接或间接地抑制了P物质的产生，从而减轻了SAP引起的肺损伤。Grady等在研究中发现，诱发胰腺炎的大鼠，与注射盐水的对照组相比，P物质及NK-1R特异性激动剂的注射均可以明显增加大鼠胰腺血浆渗出，并且这种作用可以被NK-1R的拮抗剂阻断，证实P物质通过激活NK-1R引起胰腺血浆外渗，清胰汤也可能通过某种途径下调了NK-1R的表达而对SAP肺损伤起到治疗作用。具体是通过什么机制来发生作用，尚需要进一步的实验来证实。

参考文献

[1]Lizi,WuCT,LuLR,etal.Raditiona1ChinesemedicineQingYiTang,alleviatesoxygenfreeradicalinjuryinacutenecrotizingpancreatits.WorldJGastroenterol,1998，4:357-359.

[2]LiYY,LiXL,YangCX,etal.EfectsofTetrandrineandQYTonlCAM-landSODgeneexpressioninpancreasandliverofratswithacutepancreatitis.WorldJGastroenterol,2003，9:155-159.