重叠延伸PCR法构建肿瘤抑素核心活性部位T3肽

顾丽1张君2高静3苏燕4(通讯作者)

（1包头医学院病原生物学教研室内蒙古包头014060）

（2民航总医院检验科北京100123）

（3包头医学院病原生物学实验室内蒙古包头014060）

(4包头医学院生物化学与分子生物学教研室内蒙古包头014060)

【摘要】目的利用重叠延伸PCR技术，构建肿瘤抑素核心活性部位T3肽。方法根据T3肽cDNA序列，人工设计合成三段引物，采用重叠延伸PCR技术扩增目的基因片段T3，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分离后，纯化回收扩增产物。将纯化回收的T3片段克隆至T载体，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性克隆，提取质粒，双酶切电泳鉴定后进行DNA序列测定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增获得预期大小的目的基因。质粒测序显示目的基因序列与GenBank中记载的cDNA序列完全一致。结论成功构建T3肽基因序列。

【关键词】肿瘤抑素T3肽重叠延伸PCR

【中图分类号】R318【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）03-0020-02

Overlap-extensionPCRtoconstructthecoreactivitysiteT3peptideoftumstatin

GULi1,ZHANGJun2,GAOjing3,SUYan3*(1.DepartmentofpathogenBiology,BaotouMedicalCollege,InnerMongoliaBaotou014060;2.LaboratoryofGeneralHospitalofCivilAviation,Beijing100123;3.PathogenBiologyLaboratoryofBaotouMedicalCollege,InnerMongoliaBaotou014060;4.Departmentofbiochemistryandmolecularbiology,BaotouMedicalCollege,InnerMongoliaBaotou014060,China)

【Abstract】ObjectiveToconstructthecoreactivitysiteT3peptideoftumstatinbyemployingtheoverlapextensionPCRMethodsAccordingtothecDNAsequenceofT3peptide,designedandsynthesizedthreeprimerstoamplifythetargetgenefragmentT3usingoverlap-extensionPCRtechnique.Theamplificationproductswereseparatedandpurifiedbymeansofnondenaturingpolyacrylamidegelelectrophoresis.ThepurifiedT3fragmentwasinsertedintoTvector,thentransformeditintoEscherichiacoliDH5α.Theplasmidwasextractedfrompositiveclones,andthenidentifiedbydoubledigestion.Thisrecombinantplasmidcontainingthetargetgenewassequenced.ResultsAgarosegelelectrophoresisshowedthattheexpectedsizeofgenefragmentwasamplified.PlasmidDNAsequencingshowedthatthetargetgenesequencewasthesameasthecDNAsequencerecordedinGenBank.ConclusionThegenesequenceofT3peptidewassuccessfulconstructed.

【Keywords】TumstatinT3peptideOverlap-extensionPCR

抗血管新生（angiogenesis）理论[1,2]认为，肿瘤的生长、浸润和转移都有赖于新血管的生成，如果新生血管的生成被抑制，则细胞的营养供应被阻断，肿瘤细胞便无法增生和转移，甚至发生坏死或凋亡。

肿瘤抑素（tumstatin）是最新发现同时也是目前已知的活性最强的内源性血管生成抑制因子，它靶向作用于分裂型血管内皮细胞，通过特异性抑制内皮细胞的蛋白质合成，诱导内皮细胞的凋亡，进而抑制内皮细胞的增殖和迁移，使肿瘤生长所必需的新毛细血管的形成被抑制，从而抑制肿瘤的生长、浸润和转移[3-5]。

Tumstatin是来源于人血管基底膜IV型胶原蛋白（ColIV），相对分子量为28kD的多肽片段，包含ColIVα3链中间三螺旋区C-端的12个氨基酸和非胶原区（NC1）232个氨基酸，共244个氨基酸，由738个核苷酸编码[5,6]。在深入研究tumstatin抗血管生成和抗肿瘤活性过程中，Maeshima等[7]克隆了相互间氨基酸序列有重叠的8个多肽片段，并将其命名为Tum1～8，最终将其抗血管生成活性定位于第54～132位氨基酸残基，即Tum5片段。Tum5活性由一级结构决定，改变二级结构对其活性无影响。进一步研究发现Tum5的第69～88位氨基酸与全长的tumstatin具有同等的抑制血管生成活性，而C-末端片段则无抗血管生成效能，锁定此片段为tumstatin核心活性部位，命名为T3肽[7,8]。T3抗肿瘤血管生成活性强，特异性高，且分子量较小，给药途径多样，使其在众多血管生成抑制因子中有望成为颇具潜力的分子靶向抗肿瘤血管生成生物制剂[9]。

本实验采用PCR重叠延伸法构建T3肽基因片段，为进一步研究其功能奠定了基础，同时也为开发T3肽与其他具有抗乳腺肿瘤活性的功能蛋白、免疫因子或细菌外毒素等的偶联提供了有利的工具。

1材料和方法

1.1材料

TaqDNAPolymerase、T4DNAligase、pMD18-TVector、NdeI、XhoI均购自大连TaKaRa公司，质粒小量提取试剂盒（AxyPrepTMPlasmidMiniprepKit）购自美国Axygen公司，E.coliDH5α购自德国默克Novagen公司，引物合成和DNA序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。

聚丙烯凝胶回收buffer：醋酸钠1M，EDTA2mM。

1.2方法

1.2.1T3的PCR扩增

根据GeneBank中人tumstatincDNA序列（NO.AF258351.1）中69-88位氨基酸，即T3之编码序列，采用重叠延伸PCR技术人工设计合成首尾两段引物和中间一段重叠/互补引物，在上游引物（引物1）的5'端引入限制性内切酶NdeI识别序列，随之亦引入了ATG起始密码子，下游引物（引物3）的5'端引入XhoI识别序列，引物2的5'端与引物3的3'末端重叠，3'端与引物1的3'端互补（引物1：5'CATATGCTGCAGCGATTTACCACAATGCCA3'，引物2：5'CATTGACATTGCAGAATAAGAATGGCATTGTG3'引物3：5'CTCGAGAAAATTACATACATCATTGACATT3'）。将三条引物混合作为模板，两步法PCR扩增大小为72bp、两端携带NdeI和XhoI识别序列的目的基因片段T3。PCR循环条件为：预变性94℃2min；变性94℃30s，退火60℃45s，共35个循环；终延伸72℃5min。

1.2.2T3PCR扩增产物的纯化回收

制备非变性聚丙烯酰胺凝胶（8%浓缩胶，12%分离胶），将T3PCR扩增产物进行17mA恒流电泳，凝胶取下用EB染色3～5min，紫外透射灯下将含目的DNA片段的凝胶块切下（约100mg）移入1.5mLEP管，用吸头捣碎，按重量比1:5加入500μL聚丙烯凝胶回收buffer。75℃水浴6～8min，每2～3min可振荡助溶一次，至凝胶完全融化后12,000rpm离心10min，将离心得到的上清液转至一新离心管，离心10min。将上清液移入一新离心管，加入30μL醋酸钾（3M）、600μL无水乙醇和1μL糖原（20mg/mL），-20℃静置过夜。次日12,000rpm离心10min，弃上清，干燥1.5h后TE20μL回溶。

1.2.2T-A克隆及重组质粒测序

按试剂盒要求，于连接反应体系中加入纯化回收的T3基因片段，pMD18-T载体，SolutionⅠ及dH2O，16℃连接过夜。将连接反应产物全量用于转化大肠杆菌DH5α。蓝白斑筛选阳性重组子，再行PCR鉴定，挑取初鉴定为阳性之单菌落进行克隆培养，小量提取质粒，双酶切电泳鉴定，并回收酶切目的基因片段。将含有阳性重组质粒的菌液送公司进行DNA序列测定。

2结果

2.1目的基因T3的扩增

聚丙烯凝胶电泳结果显示，以3条重叠互补引物为模板，利用重叠延伸PCR的方法扩增得到与预期大小相符的目的基因T3（72bp）（图1）。

图2pMD18-T-T3测序结果

Fig.2TheDNAsequencingresultofpMD18-T-T3recombinantplasmid

3讨论

靶向技术是近年来肿瘤研究的热点，“靶向治疗”就是应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物。根据靶向部位的不同，肿瘤靶向治疗又可分为肿瘤血管靶向治疗和肿瘤细胞靶向治疗两大类。肿瘤血管靶向疗法是通过肿瘤区域新生毛细血管内皮细胞表面的特异性受体或抗原发挥作用，而肿瘤细胞靶向疗法则是利用肿瘤细胞表面表达的特异性受体或抗原作为靶向[10,11]。

Tumstatin靶向肿瘤区域血管内皮细胞，特异性抑制新生毛细血管生成，其所具备的抗肿瘤效果显著、毒性低、副作用小、反复使用不产生耐药性等优点使之成为极具潜力的新型抗肿瘤药物[10]。Tumstatin的核心活性片段T3肽在完全保存其抗血管生成和抗肿瘤效能基础上进一步减小了分子量，因此成为一种更具潜在临床应用价值的肿瘤抑制剂。然而T3肽的开发和临床应用仍面临诸如药物半衰期短、作用效果缓慢、停药后容易复发等关键问题。因此采用基因工程方法构建T3为基础的融合蛋白，开发出具有多重抗肿瘤活性的药物，不仅对于延长其循环半衰期、增强疗效、发展长效拮抗剂是行之有效的策略，而且也可能发挥药物叠加或协同作用，显示出较单一治疗更强的肿瘤抑制效力。另外，几种或多种作用机制不同的药物联合应用也代表着未来肿瘤治疗的发展趋势[12,13]。

具有特异性抗肿瘤血管生成活性的肿瘤抑素核心活性片段T3肽的构建成功，不仅为下一步对其药理学作用的研究奠定了基础，同时也为未来构建新型多功能靶向肿瘤治疗药物奠定基础。

参考文献

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基金项目：内蒙古自治区自然科学基金（No.200711020913）