TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白

王秦许健刘成桂

【摘要】目的：建立一种快速方便提取大肠杆菌膜蛋白的方法。方法：收集临床分离的大肠杆菌，利用TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，运用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）进行质谱分析，采用CiphergenProteinchip软件采集数据。重复测定20次大肠杆菌的混合标本，评价TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白的重复性。结果：TritonX-114去污剂法成功提取出了大肠杆菌膜蛋白。重复测定20次大肠杆菌的混合标本，蛋白峰的分子量变异系数均小于0.05%。结论：TritonX-114去污剂法可以快速方便的提取大肠杆菌膜蛋白，并具有很好的重复性，这不仅对大肠杆菌耐药机制和治疗方法的研究起着重要作用，也为膜蛋白的快速提取提供了新的思路。

【关键词】大肠杆菌；膜蛋白；TritonX-114；表面增强激光解析电离飞行时间质谱

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）12-0059-03

MEMBRANEPROTEINSOFESCHERICHIACOLIWEREEXTRACTEDBYUSINGTRITON-X-114WangQin,XuJian,LIiuChenggui.

ClinicalLaboratoryofChengduWomenandChildrenCenterHospital,Chengdu,Sichuan,610091,China

【Abstract】ObjectiveToestablisharapidandconvenientextractedmethodofmembraneproteinsfromEscherichiacoli.MethodsTheclinicalisolatesofE.coliwerecollected,membraneproteinsofE.coliwereextractedbyusingTritonX-114detergent,andproteinconcentrationsweredetectedbyBradfordmethod.ThemembraneproteinsofE.coliwereanalyzedbysurfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry(SELDI-TOF-MS),andthedatawascollectedbyCiphergenProteinchipsoftware.ThemixedproteinsofE.coliweremeasuredfortwentytimestoevaluatetherepeatability.ResultsThemembraneproteinsofE.coliweresuccessfullyextractedbyusingTritonX-114detergent.ThemixedsamplesofE.coliweremeasuredfortwentytimes,andtheresultsshowedthattheCVofproteininmolecularweightwaslessthan0.05%.ConclusionThemembraneproteinofE.colicanbeextractedquicklyandeasilybyusingTritonX-114detergent.Thismethodhasgoodrepeatability,whichprovidesanewideafortheextractionofmembraneprotein,thisstudynotonlymakeanimportantroleintheresearchofE.coliresistancemechanismsandtreatment,butalsoisbeneficialtothefurtherstudyofmembraneproteomics.

【Keywords】Escherichiacoli;Membraneprotein;TritonX-114;SELDI-TOF-MS

大肠杆菌(E.coli)是引起临床感染最常见的革兰阴性杆菌，该菌易产生超广谱B-内酰胺酶（ESBL），从而导致对第三代头孢菌素耐药，甚至引起严重的院内感染暴发[1]。近年发现，大肠杆菌膜蛋白在致病和耐药过程中起着重要作用[2-3]，研究人员发现外膜蛋白具有较好的免疫原性，对感染有一定的保护力，因此研制大肠杆菌膜蛋白疫苗来预防和治疗大肠杆菌感染也成为了热点[4]。

然而由于膜蛋白的疏水性和异质性，膜蛋白的提取限制了大肠杆菌耐药机制和疫苗的研究，提取膜蛋白的方法有月桂酰基氨酸钠法，电泳法，蔗糖密度梯度离心法，两相分配法等，这些方法耗时长，步骤繁多，设备要求高，并存在其它细胞器或非膜蛋白的污染。本研究运用TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白，建立一种快速提取膜蛋白的方法，并证实与质谱分析相匹配，为大肠杆菌耐药机制和疫苗的研究奠定了基础，也为膜蛋白组学的发展提供了新的思路和方向。

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1菌种

大肠杆菌：来自成都市妇女儿童中心医院检验科微生物室2016年4月临床标本。

1.1.2主要试剂

TritonX-114（购自Amresco公司），考马斯亮蓝染液（CBBG-250），蛋白酶抑制剂(TMSF)，PBS(含5mMMgCl2)，丙酮，芥子酸（SPA），UREA液（含7molUREA和2%CHAPS）。

1.1.3仪器

高速冷冻离心机；FA1104电子天平；AU蛋白芯片；SELDI-TOF-MS仪和ProteinchipSoftware分析软件。

1.2方法

1.2.1收集菌株

收集成都市妇女儿童中心医院检验科微生物室2016年4月临床标本中经VITEK2CompactSystem全自动微生物鉴定及药敏分析系统鉴定的大肠杆菌。

1.2.2大肠杆菌膜蛋白的提取

配制蛋白提取液(含1%TritonX-114，150mMNaCl，10mMTris-HCl，1mMEDTA)。PBS洗涤3次，4℃10000g离心15min收集菌体。沉淀加入1.5ml提取液（4℃，1%TritonX-114）和10μlPMSF，4℃放置1h，10000g离心15min，取上清。重复离心1次取上清。向上清中加入10μl纯TritonX-114和5μlPMSF，37℃放置10min。室温1000g离心5min分层。

1.2.3丙酮沉淀膜蛋白

分离液相和去污剂相，分别用1.0ml丙酮在-20℃沉淀过夜。4℃10000g离心30min，弃上清。

1.2.4Bradford法测定蛋白浓度

在eppendorfBiophotometerplus仪器上，595nm处进行蛋白浓度测定。

1.2.5SELDI-TOF-MS检测膜蛋白表达图谱

运用SELDI-TOF-MS分析膜蛋白指纹图谱。BiomakerWizardSoftware和ProteinchipSoftware分析软件自动采集数据。

1.2.6SELDI检测大肠杆菌膜蛋白的重复性

随机取20管等重的大肠杆菌，AU芯片点样，重复20次，选择最优条件检测膜蛋白，BiomakerWizardSoftware和ProteinchipSoftware分析软件自动采集数据。

1.3统计学分析

采用软件SPSS16.0对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x-±s）表示组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1膜蛋白定量结果

测定膜蛋白浓度，结果显示去污剂相膜蛋白的平均浓度是1116.4μg/ml，蛋白质量/湿菌重是22328μg/g。液相膜蛋白的平均浓度是10715μg/ml，蛋白质量/湿菌重是214300μg/g。

2.2大肠杆菌膜蛋白指纹图谱

结果显示AU芯片能捕获去污剂相中近60个细菌膜蛋白峰，液相中近50个细菌膜蛋白峰，见图1。

3.讨论

大肠杆菌为临床常见分离菌和致病菌，随着抗菌药物的使用，其ESBLs阳性率高达66.2%，它已成为医院感染的主要病原菌，临床分离率占24%，如不积极治疗，产ESBLs大肠杆菌可致医院感染，存在暴发性流行风险[5-7]。大肠杆菌膜蛋白在致病和耐药过程中发挥着重要作用，它是膜的主要成分和抗生素进入细菌的主要途径和毒物作用的靶点[8]，膜蛋白的缺失或改变是细菌多重耐药的机制之一，但膜蛋白的提取限制了其耐药机制和疫苗研究。

蛋白质组学技术在水溶性蛋白研究中取得了长足的发展，但因为膜蛋白的疏水性、异质性和低丰度，尽管研究发现膜蛋白约占整个基因组编码蛋白的1/3，并代表2/3的现存和未来的药物作用靶点[9-10]，但其研究资料甚少。TritonX-114是一种非离子型的温和去垢剂，具有低“雾点”（22℃）的特性，它在0℃时能与水溶液混合形成一个均质液相，当温度超过20℃时分成两个相：一个富含胶束的表面活性剂相（疏水相），一个几乎不含胶束的水相（亲水相），此时疏水性物质由于溶于表面活性剂形成的胶束之中，分相后就进入去污剂相中，而亲水性物质则留在水相里[11-15]，它近年来被广泛的用于细菌和细胞膜蛋白，疏水性的激酶以及组织成分等的提取[12-15]。本研究TritonX-114在两小时内提取了未经机械破碎的大肠杆菌膜蛋白，并运用SELDI-TOF-MS进行质谱分析，成功建立了快速提取大肠杆菌膜蛋白的方法。实验结果证明应用TritonX-114提取膜蛋白的操作简便，可以省去溶菌酶处理或超声破碎等碎菌过程，更利于临床广泛应用。

本研究采用TritonX-114去污剂提取膜蛋白，直接用SELDI-TOF-MS鉴定膜蛋白，省去了蛋白组学分析中常用的双向电泳的步骤，方法更简便易行，同时避免膜蛋白丢失。蛋白定量结果显示用此法可获得较高的蛋白提取率和重复性，SELDI-TOF-MS分析结果提示1%TritonX-114溶解效果很好。本实验建立了一种快速有效地提取膜蛋白的方法，它操作步骤简单，节约时间（两小时内），仪器设备要求低，影响因素少，结果准确，提取效率高，十分有利于大肠杆菌耐药机制和疫苗的研究，此外，在蛋白鉴定分析方面，它与检测速度快，样本用量小，蛋白质分子质量范围大，重复性较好，敏感性、特异性较高的表SELDI-TOF-MS兼容，所以有利于膜蛋白组学瓶颈的打破和下一步的深入研究。

【参考文献】

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基金项目：四川省卫生和计划生育委员会科研课题（编号16PJ076）