藤壶糖蛋白的提取纯化及理化性质分析

曲有乐1崔宇鹏2张宇2

(1浙江海洋学院食品与药学院浙江舟山316000)

(2佳木斯大学药学院黑龙江佳木斯154002)

【摘要】目的探讨藤壶糖蛋白（BGP）的最适提取方法并对所得糖蛋白进行纯化和理化性质分析。方法分别采用水提醇沉法、盐溶液提取法、磷酸盐缓冲溶液提取法提取糖蛋白，以离子交换层析和凝胶柱层析分离纯化，SDS-PAGE鉴定纯度，再用IR进行基团结构分析。结果选择磷酸盐缓冲溶液提取法，经分离纯化得到3个BGP较纯组分，分别为BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ和BGP-Ⅲ，相对分子质量分别为123500、96300和72800；糖苷键类型属O-型糖苷键，皆具有糖蛋白的红外特征吸收。结论合适的提取方法对得到BGP至关重要，BGP属较大分子，结构和性质很复杂。

【关键词】藤壶糖蛋白（BGP）提取纯化理化性质分析

【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）32-0012-02

糖蛋白（Glycoprotein）是一类由糖链与多肽链或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白，研究证实其具有很好的抗肿瘤活性。对海洋动物糖蛋白的研究目前已成为一个热门[1-3]。本文对采自浙江舟山嵊泗列岛的藤壶进行了糖蛋白的提取和纯化并分析理化性质，为后续在对其抗肿瘤活性方面的研究奠定了理论基础。

1实验材料与仪器

1.1材料

1.1.1动物：藤壶全脏器，采自浙江舟山嵊泗列岛。

1.1.2材料及试剂：DEAE-52纤维素，SephadexG-100凝胶，透析袋，次高分子量标准蛋白，磷酸氢二钠等。

1.2仪器：高速冷冻离心机，真空冷冻干燥机，紫外分光光度计，傅立叶红外光谱仪等。

2方法

2.1BGP的提取

2.1.1水提醇沉法：藤壶全脏器匀浆，称取100g，加入600mL蒸馏水，于60℃下浸提4h，8层纱布过滤，离心（12000r?min-1，20min，4℃，以下离心条件皆相同）,浓缩，无水乙醇沉淀24h，离心，沉淀冻干。

2.1.2盐溶液提取法：藤壶全脏器匀浆，称取50g，加入1.5moL?L-1NaCl溶液600mL，微波辅助提取（40℃，360Hz，200W，9min），过滤，离心，梯度透析，冻干。

2.1.3磷酸盐缓冲溶液提取法：藤壶全脏器匀浆，称取500g，4℃下以2000mL0.2moL?L-1（pH7.4）的磷酸盐缓冲溶液浸提12h，上清液以硫酸铵盐进行分级沉淀，分别使硫酸铵含量达到40%、60%、100%三个级别，每级沉淀3h，离心,透析，冻干。

2.2BGP的纯化

2.2.1DEAE-52离子交换层析：精称经2.1.3法得到的BGP粗品200mg，以4mL蒸馏水溶解，上样。分别以水、0.1moL?L-1NaCl溶液、0.5moL?L-1NaCl溶液进行梯度洗脱，流速1mL?min-1，在280nm测其紫外吸收。每管取1mL，加入6%苯酚0.5mL和浓硫酸2.5mL，摇匀，冷却，静置20min，在490nm测其紫外吸收。合并吸收曲线的重叠峰位，冻干。其它粗品处理方法同上。

2.2.2Sephadex-100凝胶柱层析：精称BGP组分400mg，以4mL蒸馏水溶解，上样。以蒸馏水洗脱，流速1mL?min-1。后续处理方法及其他组分处理方法同2.2.1。

2.3BGP的含量测定

2.3.1糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定BGP中的总糖含量。

2.3.2蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法测定BGP中的蛋白含量。

2.4BGP的糖苷键结构分析

精称凝胶柱纯化组分10mg加入到0.1moL?L-1NaOH溶液中，40℃恒温水浴5h。并设置空白对照组，测240nm处的紫外吸收。对比碱液处理前后紫外吸收变化情况。

2.5BGP的相对分子量测定

采用SDS-PAGE法测定BGP组分的相对分子质量。以考马斯亮蓝R250做指示剂，次高分子量标准蛋白作对照。以各标准蛋白的相对迁移率对它们的相对分子质量的对数做标准曲线，根据各BGP组分的相对迁移率通过标准曲线求得各相对分子质量。

2.6BGP的红外光光谱分析

将样品与KBr混合研细，压片，扫描其在4000～400cm-1范围的透光率。

3结果

3.1BGP的提取方法比较

采用UV法对三种不同提取方式下得到的BPG粗品进行跟踪监测。其中水提醇沉法所得粗品在280nm下无紫外吸收，在490nm有一强吸收；盐溶液提取法所得粗品则相反；经磷酸盐缓冲溶液提取法所得三种粗品在280nm和490nm处均有一吸收。

3.2BGP的分离纯化

采用磷酸盐缓冲溶液提取法所得三个级别的BGP粗品（分别记为BGP-a、BGP-b和BGP-c）分别经离子交换层析进行分离纯化，得到7种BGP组分（分别记为BGP-1～BGP-7）。经SDS-PAGE鉴定，由粗品BGP-c分离得到的组分BGP-7为主要组分。将组分BGP-7经凝胶柱进一步纯化，收集到三个峰，即纯化组分BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ。BGP-Ⅲ。

3.3BGP的含量测定结果

对纯化组分BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ的组成分析见表1

表1纯化组分BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ中总糖与蛋白含量

3.4BGP相对分子质量测定结果

根据各种标准蛋白的相对迁移率（Mr）与其相对分子质量的对数（logMw）做标准曲线，方程为lgMw=-0.9788Mr+5.3698（R2=0.9907），根据各区带的迁移情况，可得BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ的相对迁移率自上而下分别为0.28、0.39和0.52，得出BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ相对分子质量分别为123500、96300和72800。

3.5BGP中糖苷键类型分析

可通过稀碱溶液处理前后紫外吸收的变化来确定糖苷键类型[70-71]。BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ在经β-消除反应处理后，在240nm处的紫外吸收情况与处理之前出现显著变化，说明BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ的糖苷键类型为O-型糖苷键。

3.6BGP的红外光谱分析

红外光谱分析显示BGP-Ⅰ、BGP-Ⅱ、BGP-Ⅲ在3446cm-1、2922cm-1、1650cm-1、1544cm-1、1400cm-1等处均有吸收峰。其中3446cm-1处是羟基的伸缩振动；2922cm-1处是C-H伸缩振动，这两处皆为糖类物质的特征吸收峰；1650cm-1和1544cm-1处为C=O的伸缩振动和N-H的变角振动；1400cm-1为C-H变角振动吸收峰。

4结论

水提醇沉法更适用于多糖类物质的提取，盐溶液提取法的浸提环境不够温和，蛋白成分易变性，且不易得到糖链结构。故经比较后认为磷酸盐缓冲溶液提取法最为合适BGP经SDS-PAGE法和凝胶柱层析法可获得较为理想的纯化效果，但最终所得的纯化组分并不是完全意义上的单一组分。BGP分子量偏大，粘性较强，常规的HPLC仪无法将其分离纯化。

对藤壶机体糖蛋白进行制备和分析之后，对其进行抗肿瘤活性方面的深入研究是十分必要的，也有待科研工作者的进一步探索。