AnnexinA1在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌分子分型的关系

陈祥义王振

【摘要】目的：通过检测膜联蛋白A1(AnnexinA1)在正常乳腺组织、乳腺良性增生性病变、导管内癌、浸润性导管癌及对应的淋巴结转移灶中的表达情况，探讨AnnexinA1在乳腺癌发展中的临床意义。方法：收集伴有淋巴结转移的浸润性导管癌的石蜡标本180例，并从中挑选出同一石蜡切片中包含正常乳腺组织、乳腺良性增生性病变、导管内癌及浸润性导管癌连续性病变的标本36例。采用免疫组织化学Envision法比较AnnexinA1在乳腺癌发生发展过程中的表达差异；在浸润性导管癌组织中检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、HER-2、Ki-67、CK5/6、表皮生长因子受体（EGFR）的表达，进行分子分型，分析AnnexinA1在不同分子亚型中的表达差异。结果：在36例连续性病变组织中，AnnexinA1在正常乳腺组织及良性增生性病变中的阳性表达率为100%（36/36），分别明显高于其在导管内癌中的表达水平27.8%（10/36）、浸润性导管癌中的表达水平16.7%（6/36），差异均有统计学意义（P＜0.01）。在180例乳腺浸润性导管癌组织中，AnnexinA1的阳性表达率为26.1%（47/180），且在相对应的淋巴结转移灶中同步表达。AnnexinA1在不同的乳腺癌分子分型中存在表达差异，其中在基底细胞样型中表达水平最高，阳性表达率为83.7%（36/43），分别明显高于管腔A型8.7%（4/46）、管腔B型7.5%（3/40）、HER2过表达型5.7%（2/35）、正常乳腺样型12.5%（2/16），差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论：AnnexinA1在正常乳腺组织及良性增生性病变中阳性表达，随着乳腺癌的发展，在导管内癌、浸润性导管癌及转移灶中表达显著降低，提示AnnexinA1的表达可能是乳腺癌发生发展过程中的早期事件。而AnnexinA1的表达水平在不同的分子分型中存在差异，在基底细胞样型中高表达，提示其有望成为指导患者个体化治疗及预测预后的一个重要指标。

【关键词】膜联蛋白；乳腺癌；分子分型

【中图分类号】R737.9【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）36-0080-03

膜联蛋白A1(AnnexinA1)属于Annexin家族成员，具有钙依赖性的磷脂结合功能，参与糖皮质激素调节的炎症反应、细胞的增殖、分化、凋亡和信号转导[1]。研究显示，AnnexinAl的表达具有不同的组织和器官特异性，导致其在各种肿瘤中表达的差异[2]。

目前，AnnexinA1在乳腺癌中的表达研究显示升高和降低两种截然相反的结果，而AnnexinA1常高表达于耐药的乳腺癌细胞系中，提示AnnexinA1可能参与乳腺癌的发生及化疗耐药[3,4]。近年来，对乳腺癌进行分子分型，已成为指导患者个体化治疗及预测预后的重要手段[5]。本研究通过检测AnnexinA1在正常乳腺组织、乳腺良性病变、导管内癌、浸润性导管癌及对应的淋巴结转移灶中的表达情况，分析其与乳腺癌的发生发展及分子分型的相关性，初步探讨其在乳腺癌个体化治疗中的意义。

1.材料与方法

1.1一般资料

收集2002年1月至2012年12月浙江省嘉兴市第一医院经改良根治切除术、伴有淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌标本180例，并从中挑选出同一石蜡切片中包含正常乳腺组织、乳腺良性增生性病变、导管内癌及浸润性导管癌连续性病变的标本36例。所有病例均由2名高年资病理医生复诊明确诊断。患者均为女性，年龄32～75岁，平均51.2岁。所有患者术前均未进行反复化疗或内分泌治疗。

1.2试剂与方法

1.2.1试剂鼠抗人AnnexinAl单克隆抗体（1:200）购自美国Abcam公司；即用型鼠抗人CK5/6单克隆抗体、鼠抗人HER2单克隆抗体、兔抗人ER单克隆抗体、兔抗人PR单克隆抗体、兔抗人表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体以及兔抗人Ki-67单克隆抗体、柠檬酸抗原修复液、DAB显色剂及抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。PathVysion探针试剂盒（购自美国雅培公司）。

1.2.2方法所有标本均经过中性福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚切片，HE染色，光镜下观察。免疫组织化学（IHC）采用Envision二步法。IHC显示HER2不确定时，采用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）方法进一步检测。

1.2.3结果判定采用双盲双盲法统计，IHC：（1）AnnexinAl染色评分参照文献并加以改进。低倍镜下选择5个有代表性的区域，然后在高倍镜下根据染色强度及阳性细胞百分比进行判读：＞5%细胞胞质棕黄色染色为阳性。（2）ER、PR以≥1%的肿瘤细胞胞核呈任何强度的着色为阳性。（3）HER-2判读标准:0：为无着色，或≤10%的浸润性癌细胞呈不完整的、微弱的细胞膜着色；1+：＞10%的浸润性癌细胞呈不完整的、微弱的细胞膜着色；2+：＞10%的浸润性癌细胞呈不完整和/或弱至中等强度的细胞膜着色，或≤10%的浸润性癌细胞呈强且完整的细胞膜着色；3+：＞10%的浸润性癌细胞呈强且完整的细胞膜着色。HER-2阴性：0及1+；不确定：2+；阳性：3+。（4）CK5/6、EGFR以癌细胞呈弥漫胞质和/或胞膜着色为阳性。（5）Ki-67定位于细胞核，计数1000个肿瘤细胞，阳性细胞的与其百分比即为Ki-67的阳性指数。FISH：选择细胞核大小一致、核的边界清楚、二脒基苯基吲哚（DAPI）染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数20个浸润性癌细胞核中的双色信号：（1）阳性：HER2/CEP17比值≥2.0；或HER2/CEP17比值＜2.0，但平均HER2拷贝数/细胞≥6.0；（2）阴性：HER2/CEP17比值＜2.0且平均HER2拷贝数/细胞＜4.0；（3）不确定：HER2/CEP17比值＜2.0且平均HER2拷贝数/细胞＜6.0，但≥4.0。

1.2.4乳腺癌分子分型按照文献，分为5型：管腔A型：ER和/或PR+、HER2-、Ki-67阳性指数＜14%；管腔B型：ER和/或PR+、HER2+和/或Ki-67阳性指数≥14%；HER2过表达型：ER-、PR-、HER2+；正常乳腺样型：ER-、PR-、HER2-、CK5/6-、EGFR-；基底细胞样型：ER-、PR-、HER2-、CK5/6和/或EGFR+。

1.3统计学方法

应用SPSS19.0统计软件进行数据分析。AnnexinA1在不同组织中表达情况的比较采用Chi-square检验，检验水准α=0.05。

2.结果

2.1AnnexinA1在36例含有正常乳腺组织、乳腺良性增生性病变、导管内癌及浸润性导管癌中的表达情况（表1）

AnnexinA1在正常乳腺组织、良性增生性病变的导管腺上皮及肌上皮中均阳性表达，AnnexinA1在导管内癌、浸润性导管癌中的表达水平显著降低，与在正常乳腺组织及良性病变中的表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。而导管内癌组与浸润性导管癌组的表达差异无统计学意义（P=0.257）。

2.2AnnexinA1在乳腺浸润性导管癌组织与相应的淋巴结转移灶中的表达情况

在乳腺浸润性导管癌组织中，AnnexinA1的阳性表达率为26.1%（47/180），且在相应的淋巴结转移灶中同步表达。

2.3AnnexinA1在不同的乳腺癌分子分型中的表达情况（表2）

根据ER、PR、HER-2、Ki-67、CK5/6、EGFR的表达结果将180例浸润性导管癌分为5型：其中管腔A型46例、管腔B型40例、HER2过表达型35例、正常乳腺型16例、基底细胞样型43例。AnnexinA1在不同的乳腺癌分子分型中存在表达差异，其中在基底细胞样型中表达水平最高，与管腔A型、管腔B型、HER2过表达型、正常乳腺型比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

3.讨论

膜联蛋白A1(AnnexinA1)是一种37-kDa结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白和肌动蛋白调节蛋白超家族中的一员[6]。AnnexinAl作为表皮生长因子受体激酶和蛋白酶C的磷酸化底物、PLA2的抑制物，在细胞的生长、分化、凋亡、信号转导、炎性反应等方面具有重要的调节作用。它们对细胞内信息传递有着重要的作用，这些信号蛋白功能的异常，将会导致肿瘤细胞增殖调控的异常[2]。

目前，研究发现AnnexinAl的表达具有不同的组织和器官特异性，导致其在各种肿瘤中表达的差异。AnnexinA1在胰腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、胃癌中表达升高，但在鼻咽癌、前列腺癌、宫颈癌、食管鳞状细胞癌中表达降低。AnnexinA1在肺癌、肝癌及胃癌淋巴结转移灶较原发灶呈现高表达，提示AnnexinA1的表达与肿瘤的转移相关[2,7]。然而在乳腺癌中AnnexinA1的表达与肿瘤的浸润与转移的关系仍不确定，有研究发现AnnexinA1在人乳腺正常组织、良性增生组织、恶性肿瘤组织中的表达则呈现出逐渐降低的趋势，AnnexinA1与肿瘤的转移呈负相关性。同时也有研究显示相反的结果，AnnexinA1在乳腺癌的发展过程中表达增高，与乳腺癌的侵袭转移行为呈正相关[3,4,8]。本研究检测了AnnexinA1在正常乳腺组织、乳腺良性增生性病变、导管内癌、浸润性导管癌及相对应的淋巴结转移灶中的表达情况，结果显示，AnnexinA1在正常乳腺组织、良性增生性病变的导管腺上皮及肌上皮中均阳性表达；在导管内癌的肌上皮中阳性表达，其腺上皮中的表达显著降低；在浸润性导管癌及对应的淋巴结转移灶中的表达水平一致，均显著降低。以上结果提示AnnexinA1的表达可能是乳腺癌发生发展过程中的早期事件，AnnexinA1是乳腺癌恶性进展的重要相关因子。

乳腺癌是一类分子水平具有高度异质性的恶性肿瘤，即使组织学类型、病理学分期完全相同的肿瘤也可能具有不同的分子生物学改变，从而导致肿瘤治疗及预后的差异。目前将乳腺癌分为管腔A型、管腔B型、HER-2过表达型、正常乳腺样型及基底细胞样型5类，不同的分子分型对患者的个体化治疗及预后预测具有重要的指导意义[5]。通过比较乳腺癌不同的分子分型中的表达差异，我们发现AnnexinA1蛋白表达具有一下特点：（1）在大部分浸润性乳腺癌中的表达缺失，但基底细胞样型中表达保持高水平；（2）在基底细胞样型中表达水平，均显著高于管腔A型、管腔B型、HER-2过表达型、正常乳腺样型；（3）在管腔A型、管腔B型、HER-2过表达型、正常乳腺样型中的表达水平均显著降低，组间比较均无显著差异。目前研究显示，基底细胞样型乳腺癌患者多为年轻妇女，恶性程度高，侵袭性强，临床预后差，对内分泌治疗和靶向治疗效果不明显。研究显示，耐药的肿瘤细胞系中AnnexinA1的表达水平明显高于药物敏感的肿瘤细胞系，其机制可能是由于AnnexinA1增加细胞膜囊泡的聚集，将细胞中充满药物的囊泡排出细胞所致。进一步的研究需探明与AnnexinA1作用的分子，这将有利于阐明AnnexinA1诱导耐药的分子机制，有助于乳腺癌的靶向治疗。

综上所述，AnnexinA1在乳腺癌的发生发展过程中有重要的意义，其表达水平在不同的乳腺癌分子分型中存在显著差异，对患者的个体化治疗及预后预测具有重要的临床提示意义。对AnnexinA1的深入研究有助于为生物治疗提供新的靶点及途径。

【参考文献】

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[2]刘清华,朱明华.膜联蛋白A1与恶性肿瘤的关系[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(5):556-558.

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[8]BhardwajA,GanesanN,TachibanaK,etal.AnnexinA1PreferentiallyPredictsPoorPrognosisofBasal-LikeBreastCancerPatientsbyActivatingmTOR-S6Signaling[J].PlosOne,2015,10(5):e0127678.

基金项目：嘉兴市科技局项目（2014AY21030-3）.