活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用

郝雪微1阮莹2刘欣宇1顾园竹1李金桐1

（1哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院黑龙江大庆163000）

（2哈尔滨医科大学药学院黑龙江大庆163319）

【摘要】目的：研究活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用。方法：用MTT法检测乳香挥发油对结肠癌细胞SW480的抑制率，用流式细胞术检测细胞内ROS含量及细胞的凋亡率。结果：乳香挥发油对结肠癌细胞有抑制作用，同时使细胞内ROS含量增加，凋亡率增加，加入GSH后可以减少ROS含量，减少凋亡率。结论：乳香挥发油可以抑制结肠癌细胞的增殖及诱导凋亡，GSH可以通过减少活性氧含量减少细胞凋亡。

【关键词】乳香挥发油；人结肠癌细胞SW480；活性氧；凋亡

【中图分类号】R34【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2015）5-0235-02

1实验材料

药品与试剂：乳香挥发油为课题组之前制备[2]，成分大多为单萜、倍半萜、醇及酯类等，其中含量最高的成分为乙酸辛酯、橙花叔醇异丁酯、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇甲酸酯及β-榄香烯，含量分别为34.660%、18.290%、9.612%和5.614%。左旋谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)购于Sigma公司。MTT，活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)检测试剂盒、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司。

细胞及培养：人结肠癌细胞SW480细胞为本室保存,接种在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃，5%的C02环境下培养。

2实验方法

2.1MTT测定细胞的增殖活性

取对数生长期的SW480细胞，以1×105个/ml接种于96孔板(100μl/孔)，培养过夜后，加入不同浓度的乳香挥发油及活性氧清除剂(GSH),实验分组为：Control、EOF低剂量(20μg/ml)、EOF高剂量(40μg/ml)、GSH(10μg/ml)、EOF低剂量(20μg/ml)+GSH(10μg/ml)、EOF高剂量(40μg/ml)+GSH(10μg/ml)；复设3孔。药物作用12小时，弃培养基，向每孔分别加入20μl的5mg/ml的MTT存储液，并于37℃孵育4小时。之后向每孔加入150μl的DMSO,酶标仪570nm波长处测定吸光度值A。按以下公式计算抑制率(IR):IR=(1-实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)×100%。

2.2检测ROS的生成量

取对数生长期的SW480细胞，接种于6孔板培养皿中。按2.1中分6组，12小时后离心收集细胞，并用200μl的RPMI1640培养液制成单细胞悬液。然后加入10μlROS探针于37℃孵育45分钟，最后用PBS缓冲液清洗以出去未结合探针。用BDFACsAriaⅠ型流式细胞仪通过荧光密度来检测ROS的含量。GSH于乳香挥发油作用前1小时进行预处理。

2.3通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

将肿瘤细胞按照1×105/ml的浓度接种到6孔板中，培养12h后按以上分组计量加药，每个药物浓度设置3个平行孔。药物作用12h后用预冷的PBS清洗细胞两次，用结合液重悬细胞并加入AnnexinV-FITC避光孵育10min，离心沉淀细胞后用结合液重悬，并加入PI冰上避光孵育5min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4统计学方法

所有实验结果均是以3次独立实验数据分析所得。采用SPSS13.0统计学软件进行t检验及方差分析。

3结果

3.1乳香挥发油对SW480细胞的增殖抑制

结果表明乳香挥发油对细胞抑制呈剂量依赖性(图1)，分别使用浓度的20μg/ml和40μg/ml的挥发油作用12h后抑制率分别为(22.8±3.1)%和(46.1±4.7)。在使用活性氧清除剂GSH后，抑制率减少到(18.7±2.5)%和(41.4±5.4)%。

图1乳香挥发油及GSH对细胞的抑制作用

（vsControl:**P<0.01,*P<0.05;vsEOF(L):△P<0.05;vsEOF(L)+GSH:▲▲P<0.01）

3.2乳香挥发油诱导凋亡与ROS的生成增加有关

用流式细胞仪检测乳香挥发油对SW480细胞内的ROS的生成的影响(图2)。横坐标荧光强度代表ROS的生成量。结果表明乳香挥发油处理的SW480细胞ROS增加呈剂量依赖性(EOF(L)vsControl,P<0.01;EOF(H)vsControl,P<0.01;EOF(H)vsEOF(L),P<0.05)，而加入GSH可以减少ROS的生成(EOF(L)+GSHvsEOF(L),P<0.05;EOF(H)+GSHvsEOF(H),P<0.05)。

图2乳香挥发油和GSH对细胞作用下的ROS含量

3.3流式细胞仪检测乳香挥发油SW480细胞的凋亡的影响

乳香挥发油作用细胞12h后通过流式细胞仪检测结果显示，对照组、低剂量组和高剂量组的细胞早期凋亡率为(5.8±0.9)%、(14.8±2.1))%和(27.5±2.9)%，呈剂量依赖性(EOF(H)vsEOF(L),P<0.01)，在加入GSH后，凋亡率分别为(8.3±1.9)%、(12.1±2.4)%和(23.3±2.0)%。使挥发油诱导的凋亡率下降(EOF(L)+GSHvsEOF(L),P<0.01;EOF(H)+GSHvsEOF(H),P<0.05)，证明活性氧在乳香挥发油诱导的细胞凋亡中发挥作用。

4讨论

细胞内过量的ROS蓄积可以引起线粒体膜电位下降，直接诱导细胞凋亡[3]。GSH被认为是平衡细胞内氧化还原状态的重要调节因子。抗氧化剂的加入则抑制凋亡的发生，表明ROS的生成在细胞凋亡中担任了重要的作用。很多抗肿瘤药物在启动肿瘤细胞凋亡过程前，细胞内GSH被耗竭，同时伴有活性氧的蓄积[4]。将SW480细胞在乳香挥发油作用前用GSH预处理，考察GSH对乳香挥发油诱导细胞凋亡的影响。结果表明，乳香挥发油所引起的SW480细胞凋亡作用可以被GSH抑制，即提示ROS在乳香挥发油诱导的SW480细胞凋亡过程中发挥了关键作用。总之，此次实验研究表明乳香挥发油可有效的诱导人结肠腺癌SW480细胞的凋亡发生，其凋亡机制还需要进一步深入研究。

参考文献：

[1]郭辉,张玲.乳香中化学成分和药理作用的研究进展[J].食品与药品,2007,9:50-52

[2]赵金凤,周春兰,周凤琴等．乳香挥发性成分GC-MS分析[J].中国中药杂志，2011，8:112-116

[3]赵云罡,徐建兴.线粒体，活性氧和细胞凋亡[J].生物化学与生物物理进展,2001,02:168-171

[4]金春英,崔京兰.氧化型谷胱甘肽对还原型谷胱甘肽清除自由基的协同作用[J].分析化学,2009,09:1349-1353

基金项目：

黑龙江省卫生厅科技项目（2013-120）

通讯作者：

雪微，1986.03，硕士，从事抗肿瘤药物研究

作者简介：

郝雪微，1986.03，硕士，汉族，职称助教，籍贯黑龙江省绥化市，从事抗肿瘤药物研究