真菌的鉴定及药敏试验分析

姜瑛

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)11-0170-02

【关键词】真菌真菌感染药敏试验

真菌对人类健康的危害包括由病原性真菌、条件致病真菌所致的深部真菌病和浅部真菌病；由气传真菌所致的变态反应真菌症即过敏；由污染真菌产毒所致的真菌中毒症。随着医学的发展，特别是抗生素的广泛使用，大量治疗手段的开展，免疫障碍疾病的大量发生，使真菌感染的情况日益增加，医院感染中的真菌感染也不断增加，因而，掌握真菌检验的方法就成为检验工作中的一个重要组成部分。

1材料与方法

1.1真菌来源收集临床送检标本所分离出的真菌120例，男性84例，女性36例，其中痰液96株，粪便11例，咽拭子12例、尿液5例、血液4例，分泌物3例。

1.2采集及处理根据真菌侵犯组织和器官的不同而采集不同的标本，而采集最合适的标本是决定能否找到病原性真菌的关键，要尽量用消毒方法采集标本以免污染。深部真菌病的标本如血液、脑脊液、脓液、尿、痰等应及时收集检查，一般不超过1～2h，以免变质污染，标本采取前，应忌用药。为避免污染杂菌，在收集标本时，应严格无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。

1.3检验方法

1.3.1酵母样菌的检验直接涂片法各类标本，除脑脊液、尿、胸水、腹水等需离心沉淀后取沉淀物作涂片外，其他均可用生理盐水或10％～40％KOH作涂片后直接镜检或用革兰、墨汁、0.1％甲苯胺蓝染色后镜检。分离酵母样菌所选用的培养基为沙保弱固体或液体培养基，在培养基中可加入各种抗生素抑制细菌的生长、有利于真菌生长含抑制剂的霉菌琼脂。将备类标本直接接种上述培养基，除新型隐球菌需同时接种两支培养基；一支孵育于37℃，另一支孵育于22～28℃，其他酵母菌均孵育于22～28℃。每日观察生长情况。根据酵母菌在培养基上的菌落特征及在玉米粉吐温80培养基上生长物在显微镜下生长情况可作初步鉴定。

1.3.2丝状真菌的检验某些丝状真菌如孢子丝菌或荚膜组织胞浆菌的直接涂片，必须染色后检查。真菌的形态和结构通过染色更为清楚，不染色涂片不易保存，染色涂片可长期保存。

1.3.3药敏试验

酵母样菌的菌液制备。于30℃培养48～72h，在斜面培养基上将菌苔制成真菌悬液，最后调制浓度为106～108个菌落/ml备用。丝状真菌的菌液制备。取经培养形成的菌落，用0.05％吐温80灭菌生理盐水加入试管中，用白金耳摩擦菌落，使孢子充分游离于液体中，然后用两层灭菌纱布过滤，以去掉琼脂块或菌丝体，最后调制浓度为106～107个菌落/ml备用。

2结果

临床标本中痰液标本真菌检出率最高67例，大便32例，咽拭子7例，尿液5例，分泌物4例，血液5例。分离的120例真菌中，白色念珠菌为主有62例，光滑念珠菌21例，热带念珠菌19例，近平滑念珠菌5例。药敏鉴定结果为分离的菌株对制霉菌素、两性霉素、伊曲康唑的敏感率较高，耐药率较低。

3讨论

真菌病流行病学研究表明，有两个流行趋势在不断影响着真菌病的诊断。一是致病菌种迅速增多，不断有新分离菌种的报道，以致有专家预言今后可能出现凡是真菌皆可致病的情形；二是致病菌谱的不断变化以及菌种菌株的高频率变异，这些均提示应加强真菌病的实验检查，提高鉴定和诊断水平。

致病性真菌是指能够以某种形式引起人或动物功能性或器质性损害的真菌，它们可以引起感染(真菌病)、变态反应(真菌过敏症)和毒性反应(真菌中毒症)。其中病原菌向组织内侵入、增殖所致的真菌病最为常见，临床上危害也最大。对致病性真菌的检查和鉴定是临床上正确诊断和治疗真菌病的基础。大量临床资料表明，深部真菌病治疗成功与否及预后好坏很大程度上取决于能否早期明确诊断，而各种浅部真菌感染的高发病率、高复发率以及患者对生活质量的追求也向临床医生提出新的课题，其中依致病真菌种类不同而进行个体化治疗愈来愈受到重视。深部真菌病的诊断较困难，由于临床表现不特异；微生物学和血清学试验的结果解释困难。一旦怀疑深部真菌病，必须用尽可能多的标本来源做培养，并努力获得用于镜检的临床材料。所有怀疑是深部真菌病的病例均应做血培养。

随着系统性真菌感染和抗真菌药物的不断增多，借助药敏试验进行抗真菌药物的选择越来越被人们所关注。真菌的生长速度和药物的稳定性与培养的温度有关。一般对大部分真菌可获得充分生长又不影响药物的稳定性的温度为30℃，不可使用37℃，因为部分真菌在此温度下不能充分生长，同时使用固体培养基培养时间较长时，可出现脱水、干燥现象。真菌的生长速度随着真菌种类不同而不同。白色假丝酵母菌可培养2～3d，其他酵母样真菌及生长较快的丝状菌(如曲霉)可培养3～4d，生长较慢的丝状菌(如暗色真菌)可培养7～10d，双相型真菌(除申克孢子丝菌)则应培养10～14d。试验的参照菌株应选择具所有抗真菌药物稀释度范围中值附近的MIC值。一株理想的参照株应在9个稀释度的1og2系列的第5个稀释度时生长被抑制，但在3～7稀释度之间被抑制者均可入选，在一株菌被选为对照株之前应对其进行足够长时间的监测，以证明其抗真菌药物敏感性的遗传稳定性。对照株的来源可向ATCC购买，这一途径是比较可靠的，或者从具有菌种保藏能力的机构购买。为了减少观察者之间的个体差异，即对终点判定的质量进行控制，所有从事这一试验的实验室工作人员应独立地对一株菌的结果进行观测，记录结果并将此结果与有经验的观测者进行比较，增强其对终点判定的准确性。

参考文献

[1]吴邵熙.现代医学真菌检验手册［M］.北京：医科大学联合出版社出版，1998.

[2]俞树荣.微生物学和微生学检验M.北京:人民卫生出版社，1999.