RNA干扰HIF-1α对肝癌细胞系HepG2生物学特性的影响

周焕城彭广福宋越张彩云温治强徐继威温

（梅州市人民医院普外科514000）

【摘要】目的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是参与肿瘤细胞代谢的核心转录因子。本研究旨在于评估RNAi下调HIF-1a对肝癌细胞系HepG2生物学特性的影响。方法化学合成特异性HIF-1asiRNA，转染缺氧条件下培养的肝细胞肝癌细胞系HepG2，利用Westernblot技术检测转染后HIF-1a，血管生产因子，和基质金属蛋白酶2表达情况。MTT分析及裸鼠皮下接种肿瘤细胞明确细胞增殖率。结果乏氧条件培养，HIF-1α表达减少61.54%，VEGF表达减少64.71%；MMP-2表达减少53.33%。HepG2细胞增殖力下降50%，接种裸鼠肿瘤形成缓慢。结论HIF-1aSiRNA抑制HIF-1α表达，抑制肝癌细胞系生长。其机制可能与下调血管生成因子和基质金属蛋白酶表达有关。

【关键词】缺氧诱导因子-1αRNA干扰肝细胞肝癌

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）15-0078-03

前言

肝细胞肝癌是危害人类健康的第五大恶性肿瘤，每年大约500,000新发病例，肿瘤致死率位居第三位[1-2]。血管丰富是影响肝癌预后的主要原因，在肿瘤生长和转移过程起重要作用。低氧是实体瘤微环境的基本特征之一，局部缺氧微环境使肿瘤细胞的一些基因和蛋白表达发生改变。这些变化使肿瘤细胞在适应缺氧微环境的同时，也会增加肿瘤血管生成。在这个过程中转录因子HlF-l起着中枢纽带的作用[3]。

缺氧诱导因子是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体的一种转录因子[4,5]。研究证实HIF—l在动物及人体许多肿瘤中大量表达，对肿瘤的生长、血管生成、转移、凋亡及耐药皆有影响。HIF-1α与HIF-1β结合形成有转录活性的HIF-α，从而调节血管生成，肿瘤生长和凋亡等活动。常氧情况下，HIF-1α维持低浓度状态。缺氧状态下，更多的HIF-1α与HRE结合，刺激血管生成，在肿瘤细胞浸润、转移方面起重要作用。本研究旨在评估是否特异性的HIF-1asiRNA对肝癌细胞系HepG2的增殖有明显抑制作用，初步探索其机制。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂

实验使用BALB/c裸小鼠12只，雄性，体重16～18g，北京维通利华有限责任公司提供。HepG2来源于ATCC。DMEM培养基由Gibco公司提供；转染试剂（Lipofectmine2000）及转染专用培养基（Optimedian）购自Invitrogen公司；MTT增殖试剂盒购自美国Roche公司；胎牛血清由杭州四季青公司提供；HIF-1α抗体购自美国BDbioscience公司；VEGF和MMP-2抗体均购自Invitrogen公司；β-actin及羊抗鼠二抗均由Santacruz公司提供。酶联免疫检测仪为美国ThermoElectron公司产品。

1.2实验方法和步骤

1.2.1siRNA的合成HIF-1α基因(NM-001530)，Ambion网站在线设计合成2对人HIF-1asiRNA，预实验选出最有效的一对用于本实验。HIF-1asiRNA双链长度为19bp，序列为：正义链(5'-3')AUCCAGAGUCACUGGAACU；反义链(3'-5')UAGGUCUCAGUGACCUUGA。同时选取一对与人HIF-1a基因序列完全没有同源性的siRNA寡核苷酸序列作为阴性对照，均送上海生工公司合成。

1.2.2siRNA转染HepG2细胞细胞培养包括细胞复苏、细胞计数、活力测定和细胞冻存等。HepG2于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37°C、5%CO2条件下培养。细胞种于24孔板，80%融合时进行转染实验。按操作步骤用Lipofectamine2000进行转染，荧光标记对照siRNA观察转染效率达80%以上。

1.2.3免疫印迹分析siRNA转染后24h裂解细胞，SDS-PAGE电泳分离，半干电转法将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶粉封闭，HIF-1α鼠抗人抗体(1:500稀释),血管内皮生长因子抗体(VEGF,1:500稀释),基质金属蛋白酶-2(MMP-2,1:500稀释),和β-actin对照(1:3,000稀释)。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:5,000稀释)。37℃孵育2h，增强化学发光法试剂盒显影。对比分析每种蛋白的含量变化。

1.2.4MTT细胞增殖实验37℃、5%CO2条件下培养72小时后,经RNAi转染，加入10μlMTT，37℃再孵育4h，加入100μl溶解试剂，孵育过夜。酶联免疫检测仪（美国ThermoElectronCorportation）检测，计算细胞增殖率。

1.2.5裸鼠成瘤实验HIF-1asiRNA和对照siRNA转染HepG2，24h后收集细胞。选取12只裸鼠,随机分为HIF-1asiRNA实验组和对照组,背部皮下注射相应的HepG2细胞(5×106/只)。每天测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，直至21天处死动物。肿瘤体积=（肿瘤长径×（肿瘤短径）2）/2[7]。

1.3统计学分析使用SPSS13.0统计软件，计量资料用（均数±标准差）表示,各组间计量资料的比较用两样本间t-检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1siRNA转染效率检测细胞种于24孔板。三复孔操作，调整siRNA的终浓度和脂质体转染试剂的用量到最小有效量，优化转染条件，提高转染效率。本文应用绿色荧光蛋白GFP标记的对照siRNA转染HepG2细胞24h，发现siRNA浓度为50nM条件下，转染效果最好，GFP标记的siRNA进入80%的细胞内。

2.2HIF-1αsiRNA抑制多种蛋白表达Westernblot结果显示特异的HIF-1a蛋白条带约120KD，转染实验重复3次，提取相应蛋白进行Westernblot检测，取3次试验的HIF-1a蛋白条带灰度与β-actin灰度比值的平均数代表HIF-1a的相对表达量。为观察抑制HIF-1a表达对血管生产的影响，同时检测VEGF和MMP-2表达量变化情况（表1）。

Westernblot结果显示实验组与对照组相比较，HIF-1a/β-actin，VEGF/β-actin，MMP-2/β-actin比值差异均有统计学意义（p<0.05）。HIF-1α表达减少61.54%。与对照组相比，VEGF蛋白表达率减少64.71%；MMP-2蛋白表达减少53.33%。缺氧培养条件下，抑制HIF-1a表达可以下调VEGF和MMP-2的表达。

表1HIF-1asiRNA实验组和

Note:t-test,★p<0.05HIF-1asiRNAgroupcomparedwithcontrolgroup

2.3HIF-1ɑsiRNA抑制肝癌细胞增殖50nmol/LHIF-1ɑsiRNA和对照siRNA转染HepG2后24hr，MTT细胞增殖实验结果显示，对照组光密度为0.72±0.10；实验组光密度降低为0.36±0.08，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。以对照组细胞为100%为参照，HepG2细胞增殖力分别下降50%。

2.4HIF-1ɑsiRNA转染HepG2肝癌细胞在裸鼠皮下生长的肿瘤生长缓慢第6-7天开始，实验组和对照组裸鼠在接种肿瘤细胞的皮下部位均出现肿瘤结节，但两组间无差别（t=690,P=0.064＞0.05）。第12天开始，HIF-1ɑsiRNA实验组的肿瘤体积比对照组的肿瘤结节小，差异有统计学意义（t=15.70,P=0.021＜0.05）。之后直至21天处死裸鼠，实验组肿瘤体积均小于对照组，差异有统计学意义（17d:t=17.98,P=0.014＜0.05；21d:t=17.43,P=0.015＜0.05）(表2)。

表2实验组及对照组裸鼠接种后

第7、12、17和21天肿瘤体积变化情况

Note:▲P＜0.05HIF-1asiRNAgroupcomparedwithcontrolgroup

3讨论

肿瘤细胞生长分化过程中局部过度缺氧是肿瘤区别与正常组织特征之一。正常条件下HIF-1a的调节是氧依赖的降解过程[6]。而缺氧可以导致HIF-1α在细胞内大量过表达，如果这一信号传递到细胞核内，将诱导一系列有关基因表达，这些基因表达产物很可能与肿瘤细胞的生物学特性有关。肿瘤细胞从而获得增殖必须的氧份和营养物质，避免细胞凋亡发生。

HIF在肝癌组织中的过表达现象已经被大量研究证实。2002年丁磊等发现肝癌组织内HIF-1a较癌旁组织明显过表达[8]。2006年穆四清等也发现不但HIF-1a在肝癌组织中表达阳性率明显超过正常肝组织，而且VEGF的阳性率也明显增加，HIF-Ia与VEGF的表达及肿瘤微血管密度的变化呈显著正相关[9,10]。傅志超等的研究也进一步证明了这一点，他们发现肝癌细胞在缺氧低于4h的情况下，HIF1a和Bcl-2随着缺氧程度的增加表达逐渐升高，而Caspase3的表达却相反,表明HIF-1a表达与与肝癌细胞的凋亡抑制有关[11]。由此我们推测人为阻断HIF-1α的表达，可以进一步抑制其下游基因的表达，达到抑制肿瘤血管生成、增殖、浸润的作用。

RNA干扰（RNAi）是细胞内一种高效序列特异性转录后基因沉默机制，是指双链RNA可以高效特异性阻断相应基因的表达[12]。HaasnootJ等早在2001年证实哺乳类细胞中短干扰RNA的转录后基因调控作用[13]。RNAi技术可关闭培养的人类细胞系几乎所有基因，为进一步研究基因功能和生物治疗靶点奠定了基础[14]。

本实验将化学合成的特异性HIF-1siRNA转染入肝癌细胞系HepG2，Westernblot结果显示实验组谱带亮度低于对照组，证实了RNA干扰成功降低了目的蛋白的水平。同时我们还证实与血管生产有关的VEGF蛋白和与肿瘤浸润有关的MMP蛋白表达都明显受到抑制，抑制率均大于50%。细胞增殖和成瘤实验进一步从功能角度证实抑制HIF蛋白表达确实能起到抑制肝癌细胞增殖的目的。我们推测HIF可能通过调控VEGF和MMP-2表达来调节肿瘤浸润和转移。HIF很可能是VEGF和MMP的上游靶点，这为针对性的肿瘤靶点治疗提供了新的思路[15,16]。

诚然，RNAi是抑制mRNA翻译的有效手段。文献报道，无论体内体外RNAi技术在肿瘤增殖和生长方面都起作用，很有希望成为肿瘤治疗的手段之一。但其完全实现临床应用还有待进一步解决如何提供转染效力，体内长期稳定维持抑制活性，机体安全性等多方面问题。

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基金号：省自然博士启动项目：S2012040007235